Rotschimmelsu-N-Demethylase (ERND)Aktivitätstests-Kit-Anleitung

Spurmethode 100T/48S

Vor der offiziellen Prüfung notwendig 2-3 Eine Probe mit größeren erwarteten UnterschiedenBedeutung bestimmen:

Zytochrom P450 Ein Enzym ist eine Gruppe von Enzymsystemen, die hauptsächlich in der Leber vorhanden sind und im Stoffwechsel fremder Substanzen, insbesondere des Stoffwechsels von Medikamenten und Giften, mitEs spielt eine wichtige Rolle. ERND inP450 Das Enzymsystem entsprichtCYP2B Untertypen, die eng mit der Demethylierung des Medikamentsmetabolismus verbunden sind. CYP2B BesitzenDer katalytische Substrat bildet inaktive, leicht ausscheidbare Stoffwechselprodukte und hat eine Entgiftungswirkung, die auch bestimmte Medikamente durchCYP2B metabolische Aktivierung.

Bestimmungsprinzip:

ERNDKatalysiert Rotschimmel su Freisetzung von Formaldehyd durchNash-Farbvergleich zur Berechnung des Formaldehydgehalts ERND 活性。

Rotschimmelsu-N-Demethylase-Aktivitätsmessung Kit Serie P450

Zusammensetzung:

Reagenz 1: Pulver x 1 Flaschen, 4℃ aufbewahren. Vor der Anwendung100 ml Destillationswasser gelöst.

Reagenz 3: Pulver x 1 Röhre, 4℃ aufbewahren. Vor der Anwendung1 ml destilliertes Wasser, vollständig gelöst.Reagenz 4: Pulver x 1 Flaschen, 4℃ aufbewahren. Vor der Anwendung0,5 ml Destillationswasser, vollständig gelöst.Reagenz 5: Pulver x 1 Flaschen, 4℃ aufbewahren. Vor der Anwendung destilliertes Wasser hinzufügen4,5 ml vollständig gelöst.

Standardflüssigkeit: Flüssigkeit x 1 Flasche - 20℃ aufbewahren. Vor der Behandlung1,5 ml EP Schlauch, beitreten 10μlStandardflüssigkeit, plus 990 μl destilliertes Wasser, 0,05 mmol/L gemischtStandardlösung von Jiaaldehyd, 4℃保存。

Die Parameter des spezifischen Produkts hängen von den Parametern ab, die die Produktbeschreibung erhalten haben

Eigene Geräte und Zubehör:

Gewöhnliche Zentrifuge, Übergeschwindigkeitszentrumphäre, verstellbare Pipette, sichtbares Spektrophotometer/Enzym-Calibrator, Spurenquartzscheine/96 Bohrplatten, DestillationWasser und Eis.

Rohenzymflüssigkeitsextraktion:

1、Entfernen Sie Zellkerne, Mitochondrien und andere Makromolekulare:Vereinbarung 0.5g Organisation, Beitritt 1 ml Reagenz 1, voll auf Eis geschliffen, 10 000g 4°C entferntHerz 30min， Entnehmen Sie die Flüssigkeit und geben Sie sie in ein Übergeschwindigkeitszentrumpfrohr.

2、Rohpartikel:100 000g，4℃, Zentrifugierung60min， Entfernen Sie die Flüssigkeit.

3、Entfernung von Verunreinigungen wie Hämoglobin:Schritt zu Schritt 2 Niederschlag hinzugefügt 1 mlReagenz 1, nach der Abdeckung vollständig schockierend gelöst, 100000gZentrifugieren 30min， Verlassen

Reinige Flüssigkeit.

4、Endliche Partikel:Schritt zu Schritt 3 Zusatz von Reagenzien II 0.5ml， Vollständig schockierende Lösung, d. h. Rohenzymflüssigkeit, zu messen. Diese Flüssigkeit muss am selben Tag verwendet werden.

Messvorgänge:

1. Spektrophotometer/Enzym-Vorwärmung 30 MinutenDie Wellenlänge einstellen 412 nm， Destillationswasser Null.

2. Reagenz 2 wird in 37Vorwärmung im Wasserbad30 Minuten。

3. Kontrollrohr:取 0,5 ml EP Schlauch, beitreten10μl Rohenzymflüssigkeit, 170 μl Reagenz 2, 10 μl Reagenz 3, 10 μl Destillationswasser, vermischt in37℃Wasserbad Isolierung 30 Minutensofort beitreten; 35 μlReagenz 5, nach Mischung in ein Eisbad 5 Minuten; 取出Anschließend beitreten 35 μl Reagenz 6, nach der Mischung bei Raumtemperatur

Ruhig 5 MinutenRaumtemperatur 8000rpmZentrifugieren 5min； Neue EP bekommenSchlauch, beitreten 100 μl Flüssigkeit, 100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60°C Wasserbad10min， Und dann raus.Mit kaltem Wasser abkühlen 5 Minutenauf 412nmMessung der Lichtabsorption, wieA Kontrolle.

4. Messrohre:取 0,5 ml EP Schlauch, beitreten10μl Rohenzymflüssigkeit, 170 μl Reagenz 2, 10 μl Reagenz 3, 10 μl Reagenz 4, nach Mischung in37℃

Wasserbad Isolierung 30 Minutensofort beitreten; 35 μlReagenz 5, nach Mischung in ein Eisbad5 Minuten; 取出Anschließend beitreten 35 μl Reagenz 6, nach der Mischung bei RaumtemperaturRuhig 5 minRaumtemperatur 8000rpmZentrifugieren 5 min; neue EPSchlauch, beitreten 100 μl Oberflüssigkeit，100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60℃ Wasserbad10min， Und dann raus.Mit kaltem Wasser abkühlen 5 Minutenauf 412nmMessung der Lichtabsorption, wieA Messrohr.

5. Standardrohr:取 0,5 ml EPSchlauch, beitreten 100 μlStandardprodukt, 100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60℃ Wasserbad10min， Dann entfernen,Kälte.

Wasserkühlung 5 Minutenauf 412nm Messung der Lichtabsorption, wieA Standardrohre.

Hinweis: Jede Probe muss kontrolliert werden.

ERND Aktivitätsrechnungsformel:

a.Die Berechnungsformel, die mit Spuren-Quarzschalen gemessen wurde, ist wie folgt:

(1).Berechnung nach Proteinkonzentration:

Definition der aktiven Einheit: 371 nmol pro Milligramm Protein pro MinuteFormaldehyd ist 1 lebende Enzymeinheit.

ERND Aktivität (nmol/min/mg)prot) = C Standardprodukt x V Standardprodukte×(Ein Messrohr - A Kontrollrohr）÷A Standard-Rohr × Verdünnungs-Vielfaches÷(Cpr × V)

wie÷T

=45 x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standardrohr ÷Cpr。

(2).Berechnung nach Probenqualität:

Definition der aktiven Einheit: 371 nmol pro Minute pro Gramm Probe katalysiertFormaldehyd ist 1 lebende Enzymeinheit.

ERND Aktivität (nmol/min/g) Gewicht = C Standardprodukt x V Standardprodukt x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standard-Rohr × Verdünnungs-Vielfaches ÷ (W × V-Muster) ÷T

=45 x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standardrohre÷W

CStandardprodukt: 0,05mmol/L = 50 μmol/L; VStandardprodukt: 100 μl = 1 x 10^-4 L; Verdünnungs-Vielfaches: VGegen-V Flüssigkeit = 50 + 850

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: Proteinkonzentration in Rohenzymflüssigkeit (mg/ml)Eine zusätzliche Prüfung ist erforderlich, empfehlen wir die Verwendung des Unternehmens.BCA

Proteingehaltsmessung Kit; W: Probenqualität, g；V Probe: das Volumen der Rohenzymflüssigkeit hinzufügen, 10 μl = 0,01 ml; T: Katalysische Reaktionszeit(m)in），

30 Minuten。

b.verwenden Die Berechnungsformel für die 96-Loch-Plattenmessung lautet wie folgt:

(1).Berechnung nach Proteinkonzentration:

Definition der aktiven Einheit: 371 nmol pro Milligramm Protein pro MinuteFormaldehyd ist 1 lebende Enzymeinheit.

ERND Aktivität (nmol/min/mg)prot) = C Standardprodukt x VStandardprodukte×(Ein Messrohr - A Kontrollrohr）÷A Standard-Rohr × Verdünnungs-Vielfaches÷(Cpr × V)

wie÷T

=45 x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standardrohr ÷Cpr。

(2).Berechnung nach Probenqualität:

Definition der aktiven Einheit: 371 nmol pro Minute pro Gramm Probe katalysiertFormaldehyd ist 1 lebende Enzymeinheit.

ERND Aktivität (nmol/min/g) Gewicht = C Standardprodukt x V Standardprodukt x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standard-Rohr × Verdünnungs-Vielfaches ÷ (W × V-Muster) ÷T

=45 x (A) Messrohr - A Kontrollrohr) ÷A Standardrohre÷W

CStandardprodukt: 0,05mmol/L = 50 μmol/L; VStandardprodukt: 100 μl = 1 x 10^-4 L; Verdünnungs-Vielfaches: VGegen-V Flüssigkeit = 50 + 850

+50+50+175+175）÷500=2.7； Cpr: Proteinkonzentration in Rohenzymflüssigkeit (mg/ml)Eine zusätzliche Prüfung ist erforderlich, empfehlen wir die Verwendung des Unternehmens. BCAProteingehaltsmessung Kit; W: Probenqualität, g；V Probe: das Volumen der Rohenzymflüssigkeit hinzufügen, 10 μl = 0,01 ml；T: Katalysische Reaktionszeit(m)in）， 30 Minuten.

Rotschimmelsu-N-Demethylase-Aktivitätsmessung Kit Serie P450