Aminobilin-N-Demethylenzyme (UND）Aktivitätstests-Kit-Anleitung

Spurmethode 100 Rohr/48 wie

Vor der offiziellen Prüfung notwendig 2-3 Eine Probe mit größeren erwarteten UnterschiedenBedeutung bestimmen:

ZytochromeP450 Ein Enzym ist eine Gruppe von Enzymen, die eine wichtige Rolle im Stoffwechsel von fremden Substanzen spielen, insbesondere von Medikamenten und Giften.UND AlsP450Ein wichtiges Mitglied des Enzymsystems, dasCYP3A4 Untertypen, die eng mit der Demethylierungsreaktion des Medikaments verbunden sind.

Bestimmungsprinzip:

UND Katalysiert Aminobilin freisetzen Formaldehyd durch Nash Der Formaldehydgehalt kann durch Farbvergleich berechnet werdenAusgang UND Aktivität.

Aminobilin-N-Demethylase-Aktivität Testkit P450

Zusammensetzung:

Reagenz 1: Pulver×1 Flasche,4℃Speichern. Vor der Anwendung 100 ml Destillationswasser ist vollständig gelöst.

Reagenz 3: Pulver×1 Rohr,4℃Lichtschutz aufbewahren. Vor der Anmeldung 1 ml Wasserfreies Ethanol, vollständig gelöst. Reagenz 4: Pulver×1Rohr,4℃Speichern. Vor der Anmeldung 0,5 mlDestillationswasser, vollständig gelöst.

Reagenz 5: Pulver×1 Flaschen bei Raumtemperatur aufbewahren. Destillationswasser vor Anwendung 4 ml Vollständig aufgelöst.

Standardflüssigkeit: Flüssigkeit×1 Flasche,-20℃Speichern. Vor der Behandlung 1,5 ml EP Schlauch, beitreten 10μl Standardflüssigkeit, plus 990 μl Destillationswasser, vermischt0.05 mmol/L Standard-Jialdehydlösung,4℃Speichern.

Die Parameter des spezifischen Produkts hängen von den Parametern ab, die die Produktbeschreibung erhalten haben

Eigene Geräte und Zubehör:

Gewöhnliche Zentrifuge, Überdrehzentrifuge, Wasserbad, verstellbare Pipette, UV-Spektrophotometer/Enzym-Calibrator, Spuren-Quarzschalen/96 LöcherPlatten, destilliertes Wasser, wasserloses Ethanol und Eis.

Rohenzymflüssigkeitsextraktion：

1、Entfernen Sie Zellkerne, Mitochondrien und andere Makromolekulare:Vereinbarung 0.5g Organisation, Beitritt 1 ml Reagenz 1, voll auf Eis geschliffen,10 000g 4℃AbHerz 30 MinutenEntnehmen Sie die Flüssigkeit in die Übergeschwindigkeitszentrumpfe.

2、Rohpartikel:4℃，100 000gZentrifugieren. 60 MinutenEntfernen Sie die Flüssigkeit.

3Entfernung von Verunreinigungen wie Hämoglobin: Schritte 2 Niederschlag hinzugefügt 1 ml Reagenz 1, nach der Abdeckung vollständig schockierend gelöst,100 000g Zentrifugieren 30 MinutenVerlassen.Reinige Flüssigkeit.

4、Endliche Partikel:Schritt zu Schritt 3 Zusatz von Reagenzien II 0.5 mlNach der Abdeckung vollständig schockierend gelöst, d. h. grobe Enzymflüssigkeit, zu messen. Diese Testflüssigkeit muss

am gleichen Tag verwendet.

UND Aktivitätsmessung:

1. Spektrophotometer/Enzym-Vorwärmung 30 MinDie Wellenlänge einstellen 412 nmDestillationswasser Null.

2. Reagenz 2 wird in 37℃Vorwärmung im Bad 30 Minuten。

3. Kontrollrohr:取 1 AbteilungEP Schlauch, beitreten 10μl Enzymflüssigkeit,170 μl Reagenz 2,10μl Reagenz 3,10μl Destillationswasser, vermischt in 37℃

Wasserbad Isolierung 30 Minutensofort beitreten; 35 μl Reagenz 5, nach Mischung in ein Eisbad 5 Minuten；取AusgangAnschließend beitreten 35 μl Reagenz 6, Raumtemperatur nach MischungRuhig 5 MinutenRaumtemperatur 8000rpm Zentrifugieren 5 Minuten; neue zu bekommenEP Schlauch, beitreten 100 μl Flüssigkeit,100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60℃Wasserbad 10 MinutenUnd dann nimm.AusgangMit kaltem Wasser abkühlen 5 Minutenauf 412nmMessung der Lichtabsorption, wieAKontrollrohr.

4. Messrohre:取 1 AbteilungEP Schlauch, beitreten 10μl Enzymflüssigkeit,170 μl Reagenz 2,10μl Reagenz 3,10μl Reagenz 4, nach Mischung in 37℃

Wasserbad Isolierung 30 Minutensofort beitreten; 35 μl Reagenz 5, nach Mischung in ein Eisbad 5 Minuten；取AusgangAnschließend beitreten 35 μl Reagenz 6, Raumtemperatur nach MischungRuhig 5 MinutenRaumtemperatur 8000rpm Zentrifugieren 5 Minuten；取 1 NeueEP Schlauch, beitreten 100 μl Flüssigkeit,100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60℃WasserBadezimmer 10 MinutenUnd dann nimm.AusgangMit kaltem Wasser abkühlen 5 Minutenauf 412nmMessung der Lichtabsorption, wieAMessrohre.

5. Standardrohr:取 1 AbteilungEP Schlauch, beitreten 100 μl Standardprodukte,100 μl Reagenz 7, nach Mischung 60℃Wasserbad 10 MinutenUnd dann nimm.AusgangMit der Kälte.Wasserkühlung5 Minutenauf412nm Messung der Lichtabsorption, wieA Standardrohre.

Hinweis: Jede Probe muss kontrolliert werden.

UND Berechnung der Aktivität:

a.Die Berechnungsformel, die mit Spuren-Quarzschalen gemessen wurde, ist wie folgt:

（1）Berechnung nach Proteinkonzentration

Definition der aktiven Einheit:37℃Produziert pro Milligramm Protein pro Minute 1nmol Formaldehyd ist 1 eine lebende Enzymeinheit.

UND Aktivität(nmol/min/mg) prot) =C Standardprodukte×V Standardprodukte×（A Messrohre -A Kontrollrohr）÷A Standardrohre×Verdünnung Vielfach÷（Cpr× Vwie)÷T

=45×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre÷Cpr。

（2）Berechnung nach Probenqualität

Definition der aktiven Einheit:37℃Pro Gramm Gewebekatalyse pro Minute 1nmol Formaldehyd ist 1 eine lebende Enzymeinheit.

UND Aktivität(nmol/min/g) Schwer ) =C Standardprodukte× V Standardprodukte×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre×Verdünnung Vielfach÷(V) wie

÷V Gesamt× W)÷T

=45×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre÷W。

C Standardprodukte:0.05 mmol / L = 50 μmol / L；V Standardprodukte:500μl = 0,0005 LVerdünnungsmehrfach:V Gegen General÷V Oberflüssigkeit=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；CprProteinkonzentration (mg/ml）Eine zusätzliche Prüfung ist erforderlich, empfehlen wir die Verwendung des Unternehmens. BCAProteingehaltsmessung Kit;VBeispiel: das Volumen der Rohenzymflüssigkeit hinzufügen,50 μl = 0,05 ml；VProbensumme: Extrahiertes Flüssigkeitsvolumen,0,5 ml；TKatalysische Reaktionszeit (Min），30 Minuten。

b.verwenden 96 Die Berechnungsformel für die Bohrplattenmessung lautet wie folgt:

（1）Berechnung nach Proteinkonzentration

Definition der aktiven Einheit:37℃Produziert pro Milligramm Protein pro Minute 1nmol Formaldehyd ist 1 eine lebende Enzymeinheit.

UND Aktivität(nmol/min/mg) prot) =C Standardprodukte× V Standardprodukte×（A Messrohre -A Kontrollrohr）÷A Standardrohre×Verdünnung Vielfach÷（Cpr× Vwie)÷T

=45×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre÷Cpr。

（2）Berechnung nach Probenqualität

Definition der aktiven Einheit:37℃Pro Gramm Gewebekatalyse pro Minute 1nmol Formaldehyd ist 1 eine lebende Enzymeinheit.

UND Aktivität(nmol/min/g) Schwer) =C Standardprodukte× V Standardprodukte×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre×Verdünnung Vielfach÷(V) wie÷VGesamt× W)÷T

=45×（A Messrohre -A Kontrollrohr)÷A Standardrohre÷W。

C Standardprodukte:0.05 mmol / L = 50 μmol / L；V Standardprodukte:500μl = 0,0005 LVerdünnungsmehrfach:V Gegen General÷V Oberflüssigkeit=（50+850

+50+50+175+175）÷500=2.7；CprProteinkonzentration (mg/ml）Eine zusätzliche Prüfung ist erforderlich, empfehlen wir die Verwendung des Unternehmens. BCAProteingehaltsmessung Kit;V Beispiel: das Volumen der Rohenzymflüssigkeit hinzufügen,50 μl = 0,05 ml；V Probensumme: Extrahiertes Flüssigkeitsvolumen,0.5 ml；TKatalysische Reaktionszeit (Min），30 Minuten。

Hinweis:

1Die Rohenzymflüssigkeit muss am selben Tag abgeschlossen werden, wenn sie aufbewahrt werden muss, wird der Schritt zur Rohenzymflüssigkeit extrahiert. 3 Niederschlag hinzugefügt 0,5 ml 20%Glycerin, nach der Aufteilung,

-80℃Aufbewahrung;

2Das Reagenz 3 und das Reagenz 4 müssen vor der Anwendung vorbereitet werden, wenn es am selben Tag nicht beendet ist.4℃Lichtschutz, verfügbar 1 Woche;

3Rohenzymflüssigkeit kann direkt zur Bestimmung der Proteinkonzentration verwendet werden, empfohlen BCA Testen Sie den Proteingehalt.

Aminobilin-N-Demethylase-Aktivität Testkit P450