TOPO-TA/Blunt Einfaches Lightning Cloning Kit

NoblaidTOPO-TA/Blunt Einfaches Lightning Cloning Kit

TOPO-TA Blunt einfaches Lightning Cloning Kit

Katalognummer：42212

Produktinhalt:

Aufbewahrungsbedingungen:

-20℃, Lagerung12 Monate ohne Auswirkungen auf die Wirkung.

Produktbeschreibung:

Die TA-Klonierung oder Blunt-Klonierung kann bei Raumtemperatur in 20 Minuten mit einer positiven Rate von nahe 100% durchgeführt werden und ist frei von Eisbad, Hitze, blauen und weißen Flecken und kann bis zu 10 kb DNA-Fragmente verbinden.

Schritte zum Klonen(≤3 KB)：

Vereinfachte Schritte(≤10kb) Abschnitt） Erholungsfrei, Flüssigkeitsfrei LB

Anschluss: 5 Minuten bei Raumtemperatur；

1. Verbindungen: 37°C Verbindung 5 Min。

2. Umwandlung: ZimmerWen 5 Uhr；

2. Umwandlung: Eisbad 5 min， 42 ° Hitze 1 min， Auf Eis. 2 Min。

Erholung: 180 rpm, 37℃ Oszillationskultur10 Minuten; Beschichtung.

3, nehmen Sie alle Bakterien beschichtet, 37 ° C umgekehrt kultiviert.

Betriebsschritte:

1. PCRHerstellung der Produkte:

a. Anforderungen: Das Element kann nicht phosphorisiert werden.

b. Enzymauswahl: nach Bedarf auswählenDie DNA Polymerase, der Träger kompatibel istPCR ProdukteA Das Ende des Friedens.

c. Elektrophoresis-PrüfungQuantität und Qualität der PCR-Produkte:

① Es gibt nur Zweckstreifen, die eine direkte Verbindungsreaktion durchführen können, ohne Reinigung;

Wenn mehrere Bänder vorhanden sind, wird empfohlen, dass das Gel DNA-Fragmente (DC011-100) zurückgewinnt;

Bei der Vergrößerung des Plasmids als Vorlage muss die Gel-Recycling durchgeführt werden, da das Vorlage-Plasmid auch eine nicht-zweckmäßige Kolonie erzeugt.

2. Verbindungsreaktion:

1） Raumtemperatur (20 °C-37 °C) Verbindungssystem (10ul) System）：

Empfohlene Dosierung für verschiedene Größen-Einsätze:

Nach dem Zusatz des Reagents mischen Sie den Rohrboden (oder blasen Sie es leicht)）Sammeln Sie alle Flüssigkeiten auf dem Zentrifugerboden.

2) Raumtemperatur (20°C-37°C)Verbinden5 Minuten. Die Verbindungsprodukte können die sensorischen Zellen direkt verwandeln oder auf Eis zurückgesetzt werden.

3. Transformation, Erholung, Beschichtung:

1）100ul Gefühlszellen, die bei Raumtemperatur aufgefroren werden (ungefähr1 Etwa eine Minute), leicht schütten Sie die Zellen mehrmals gleichmäßig suspendieren.

2） Beitritt10ul Verbindungsflüssigkeit, leicht vermischt, Raumtemperatur (20 ℃ - 37 ℃)PlatzierenFünf Minuten.

3） Beitritt500ulAusgewogen auf RaumtemperaturLBOder...SOC Kulturmedium (ohne Antibiotika), 37℃180 rpmOszillationskultur10 Min。

（Hinweis: größer als3 kb Die Oszillationskulturzeit der Fragmente wird auf 30-60 verlängert Minuten kann der Konverter erhöht werden. Oder mit vereinfachten Schritten.）

4） 取200l Bakterienbeschichtung(Enthält Ampiciqing50-100ug/ml）， Übernachtung kultivieren. (Um mehr Klonen zu erhalten, 4000 rpm Zentrifugieren1 min， Entfernen Sie einen Teil, behalten Sie100-150ul， Leichte Schuss Suspension von Bakterien, nehmen Sie alle Bakterien beschichtet)

Hinweis: Wenn verwendet5ul Die einzelnen Komponenten des Systems werden verhältnismäßig halbiert und die Anzahl der Anwendungen kann sich verdoppeln.

4. Screening-Identifizierung des Konverters:

Die positive Rate dieses Produkts ist ziemlich hoch, im Allgemeinen kann man das, was man sieht, erreichen, solange die Kolonie normal (nicht kontaminiert) ist.Bakterien, die Anzahl der Konverter ist nicht zu gering.）Im Grunde beinhaltet das Einfügen. Daher wird der Abschnitt nicht mehr als2-3kb In diesem Fall kann nicht identifiziert werden.Direkte Auswahl1-2 Bakterien zu sequenzieren.

1） KolonienPCR Detektion: Pick-up-Kolonie bei 10ul In sterilem Wasser, vermischen, nehmen Sie 1ulPlatziert in25ul PCR System,VerwendenEin PCR-Prototyp oder ein M13-Universal-Prototyp zur Identifizierung eines positiven Klons.

2）Verwenden Sie die allgemeine M13F(-20)/M13R(-26) Primiersequenzierung, um festzustellen, ob ein Zielklon enthalten ist.

pTOPO-TA/BluntTrägerplan:

pTOPO-TA/Blunt Trägersequenz:

TOPO-TA/Blunt Einfaches Lightning Cloning Kit