Das One Step Seamless Cloning Kit

NoblaidDas One Step Seamless Cloning Kit

Ein Schritt nahtloses Klonen Kit (Einzelschnitt)

Katalognummer:42111

Verpackungsmenge:

Produktlagerung:-20°C Aufbewahrung, um wiederholtes Einfrieren zu vermeiden

Die Parameter des spezifischen Produkts hängen von den Parametern ab, die die Produktbeschreibung erhalten haben

Produktbeschreibung:Ein Schritt nahtlose Klonen Kit nicht abhängig vonT4Verbindungsenzyme, die nicht durch den enzymatischen Schnittpunkt des Trägers und des Zielsegments eingeschränkt sind, während die Methode der Umrüstung von überlappenden Fragmenten direkt verwendet wird, können spezielle Enzymkombinationen die Träger nach einer beliebigen Methode linearisiert und mit ihren beiden Enden mit16-25bpÜberlappende GebietePCREine gezielte Umstrukturierung der Verbindung kann30In Minuten realisiertAEnde oder flaches EndePCRProduktfragmente orientieren nahtlose Klonen effizient an beliebige Stellen des Trägers.

Eigenschaften:

1. 30Minuten kann eine50bp-15kb PCRVergrößern Sie den Abschnitt (/ AEnd) Klonen an beliebigen Stellen eines beliebigen Trägers eingefügt.

2.Unabhängig von der Verfügbarkeit von Träger- und InsertionsfragmentenFriedens Ende/粘性末端的限Sie können an jedem Ort geklont werden.

3. Ein nahtloser Klon führt keine unerwünschten Basensequenzen durch den Einsatzpunkt.

4. Nicht abhängig von Connectase und Phosphatase, effizient, präzise, Klonpositive Rate erreichbar95%oben.

Ein Schritt nahtlose Klonen Kit Prinzip Schema:

Linearisierte Träger und EinfügeDie DNABereitstellung der Stücke:

AVorbereitung linearer Träger

(1).Quellen des Enzyms:Der entstandene lineare Träger, flaches Ende oder Klebstoff, Mono- oder Bi-Enzym-Schnitt, kann nach dem Enzym-Schnitt-Klebstoff zurückgewinnt werden.

Hinweis: Keine Doppelkette in einem Schritt nahtlose Klonen ReaktionssystemDie DNAVerbindungsenzyme, keine Träger-Selbstverbindung-Reaktion auftreten. Deshalb sind auch lineare Träger, die monoenzymatisch hergestellt werden, keine endgültige Dephosphorsäurebehandlung erforderlich. Falschpositives Klonen nach der Transformation des Rekombinationsprodukts(Kein Session eingefügt)Es entsteht durch die Transformation eines nicht linearen Ringträgers durch enzymatische Unvollständigkeit. Wir empfehlen, dass die enzymatische Rückgewinnung dieses Anteils an nicht linearen Trägern auf das maximale di reduzieren kann.

(2).UmkehrtPCRQuelle:Empfehlung für hohe TreueDie DNAPolymerase (Artikelnummer:P517-05oderP812-05(Vorbereitung, wenn ein Verstärkungsband einzeln passieren kannPCRProduktreinigung (Artikelnummer:DC012-50Erhalten Sie Träger, sonst durch Klebstoff Recycling (Warennummer:DC011-50)Zugang zu Trägern.

Hinweis: umgekehrtPCRDie Plasmidenvorlage ist auch ein nicht-linearer Träger und kann auch zu falsch positiven Klonen führen (kein Einsetzfragment), daherPCRQuellen lineare Träger (PCRProdukt vor ReinigungDpn IIntercute Enzyme Verdauung Plasmid Schablone, die den Hintergrund reduzieren und die positive Rate zu erhöhen. Aber im Allgemeinen reicht es nach der Klebstoff-Recycling aus, um den Anteil dieser nicht-linearen Träger auf die höchste Di zu reduzieren und somit umgekehrt.PCRDie Quelle der linearen Träger empfehlen wir auch die Recycling von Klebstoffen.

B: EinfügenDie DNABereitstellung der Fragmente

(1).Das allgemeine Prinzip für das nahtlose Klonen von Primären in einem Schritt ist:5’End Einführung linearer Klon-Träger-End-Homogene-Sequenz, so dass die Einführung von Fragment-Verstärkung-Produkt5’und3’Am Ende ist eine vollständig konsistente Sequenz mit den beiden Enden des linearen Klonträgers(16 bps)～20 bps)。

(2).Insertion-Fragment-Prototype-Design: Ein Klon-Prototype umfasst die Insertion von Fragment-spezifischen Prototype-Sequenzen und Überlappungssequenzen.

Klonen von positiven Vorläufern(5’-3’)Linearer Träger in Richtung16-25 ntÜberlappende Zonensequenz(3"Ende zählen)+Einfügen einer Sequenz von spezifischen Vorläufern (18-25 nt）

Umkehrtes Protokoll klonen(5’-3’): Umkehrt linearer Träger16-25 ntÜberlappende Zonensequenz(3"Ende zählen)+Einfügen einer umgekehrten spezifischen Primierfolge des Fragments (18-25 nt）

Hinweis: Mindestens die Anzahl der Basen der überlappenden Zonen16 bpund zwischen mehreren überlappenden Bereichen.TmDer Wert muss gleichbleiben und60°C (AT-Paar = 2°C und GC-Paar = 4°C)Ansonsten kann die Anzahl der Basen verlängert werden, bis die Anforderungen erfüllt sind.

Entsprechend der Struktur des Endes des linearen Trägers (5»hervorzuheben,3'hervorragend, flaches Ende), die Einführungsdesign auch geteilt3Diese Situation zeigt wie folgt:

Beide Enden der linearen Träger durch lineare Methoden (z. B. Mono-Enzym-Schnitt, Bi-Enzym-Schnitt, Umkehr)PCR(Im Gegensatz dazu kann es sich um eine beliebige Kombination von zwei oder zwei der oben genannten drei Endstrukturen handeln, und das Prinzip der Einfügung von fragmentspezifischen Vorläufern kann den Prinzipien des allgemeinen Vorläuferdesigns folgen.

Bei der Berechnung der Abkühlungstemperatur des Amplifikationsvorgangs müssen Sie einfach die gen-spezifischen Amplifikationssequenzen berechnen.TmWerte, an denen die homogene Sequenz am Ende des Trägers nicht an der Berechnung teilnehmen sollte.

(3).Enzymauswahl: Empfohlene Verwendung von hoher FidelitätDie DNAPolymer oderPCR-Mischung(Warennummer:P517-05oderP814-05）。

(4).Reaktionsbedingungen: In der Regel können die spezifischen Polymerase-Anweisungen entsprechend durchgeführt werden.

(5).Reinigung des Einsetzsegments

l Optional: Wenn das Fragment aus einer Plasmid-Vorlage stammt und das Plasmid den gleichen Widerstand wie der Rekombinationsträger aufweist, wird vor der Reinigung verwendetDpn IIntracyte Enzyme Verdauung Plasmid Schablone, die den Hintergrund reduzieren und die positive Rate erhöhen.

l Wenn es sich um ein einzelnes Stück handelt, wird empfohlenPCRProduktreinigungskit (Artikelnummer:DC012-100(Reinigungsabschnitt).

l Bei nicht spezifischer Verstärkung wird empfohlen, das Kit mit Klebstoff zu recyceln (Artikelnummer:DC011-100)Recycling von Stücken.

l Mit dieser Methode zu klonen, wird der Enzym-Schnittpunkt des Trägers zur Linearisierung beim Spleizen fehlen, wenn es strenge Anforderungen an den Enzym-Schnittpunkt gibt, wird empfohlen, die Auswahl des Enzym-Schnittpunkts zu beachten, wenn nötig, kann inÜberlappende Regionensequenzen von positiven Reverse-Klonen-Primären und spezifische GensequenzenErhöhen Sie die fehlenden Basen, um die ursprünglichen enzymatischen Schnittstellen wiederherzustellen (siehe nachfolgende Beispiele).

l Wenn das rekombinierte Plasmid für die Proteinexpression verwendet wird, achten Sie bei der Gestaltung des Primärs auf das Lesefach, die Sequenzen, die für die Proteinexpression und Reinigung erforderlich sind (z. B. Starter,RBSSequenzen, Start-Codons, End-Codons, Protein-Labels usw.) werden nicht zerstört.

Beispiele für die Gestaltung von Vorläufern (EcoR Ienzymatisch geschnitten):

Wie oben gezeigt, ist der TrägerEcor IEnzyme schneiden, bilden5„Das Ende hervorheben:

Nach den oben genannten Konstruktionsprinzipien3Beginnen Sie mit der Berechnung und rechnen Sie zurück16bp-25bp(Dieses Beispiel wird verwendet.20 bpDie Ende überlappen die gleiche Sequenz), fügen Sie vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzu. Sicherstellung überlappender BereicheTmWerte bleiben gleich und60°C (AT-Paar = 2°C und GC-Paar = 4°C)。

Die Vorläufer sind wie folgt:5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung der oben genannten Vorläufer Design,EcoR IDer Enzym-Schnittpunkt wird verschwinden (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn eine Reservierung erforderlich istEcoR IEnzym-Schnittpunkt, der am Ende des Trägers erforderlich ist20 bpKomplementierung fehlt zwischen überlappenden Sequenzen und Zielsegment-spezifischen Prototype-SequenzenEcoR IStellensequenz erkennenaattcNach Abschluss der Klonverbindung,EcoR IDer enzymatische Schnittpunkt bleibt vorhanden (behält den enzymatischen Schnittpunkt).

Genau wie folgt:5' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN3'

Ausführungsbeispiel für Umkehrprogramm (Hind IIIenzymatisch geschnitten):

Wie oben gezeigt, ist der TrägerHind IIIEnzyme schneiden, bilden5„Das Ende hervorheben:

Nach den oben genannten Konstruktionsprinzipien3Beginnen Sie mit der Berechnung und rechnen Sie zurück16bp-25bp(Dieses Beispiel wird verwendet.20 bpDie Ende überlappen die gleiche Sequenz), fügen Sie vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzu. Sicherstellung überlappender BereicheTmWerte bleiben gleich und60°C (AT-Paar = 2°C und GC-Paar = 4°C)。

Umkehrtes Element ist wie folgt:5'CTGCCATCGGATCGTGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung der oben genannten Vorläufer Design,Hind IIIDer Schnittpunkt verschwindet (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn eine Reservierung erforderlich istHind IIIEnzym-Schnittpunkt, der am Ende des Trägers erforderlich ist20 bpKomplementierung fehlt zwischen überlappenden Sequenzen und Zielsegment-spezifischen Prototype-SequenzenHind IIIStellensequenz erkennenAgctt，Hind IIIDer enzymatische Schnittpunkt bleibt vorhanden (behält den enzymatischen Schnittpunkt).

Genau wie folgt:5' CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Schritte zur nahtlosen Klonreaktion:

Hinweis:2 × OneStep KlonmischungEnthält VerbindungsverstärkerPEGSehr klebrig, aus dem Kühlschrank zu nehmen, wenn die Temperatur niedrig ist, klebriger, kann in der Hand für ein paar Minuten zu schmelzen, um die Temperatur zu erhöhen, um die Viskosität zu verringern (ohne Auswirkungen auf die Qualität), leicht zu mischen, sofort Zentrifugal auf den Rohrboden zu sammeln.

1. Entsprechend der folgenden Tabelle können Reaktionssysteme erstellt werdenPCRZubereitung von Rohren bei Raumtemperatur)

* Fahrzeuge allgemein20-50 ngEinfügen Sie das Stück mit dem Träger Morphi in2:1-3:1zwischen den besten; Wenn der Abschnitt kleiner ist als200bpEinsetzen von Segmenten und Trägern mit Morbiditätsverhältnis5:1。

2. Leicht vermischt, in50°CReaktion15Minuten (verfügbar)PCRnach dem Ende der Reaktion wirdPCRDirekt auf dem Eis verwandelt oder gespeichert-20°CKürzere Stücke zum Beispiel100bp-1kbNur brauchen.15Innerhalb von Minuten können genügend Transformatoren erhalten werden, längere Teile der Verbindung können die Reaktionszeit verlängern.60Minuten.

3. 取5 μlDie Reaktionsprodukte werden gemäß der Anleitung der Sensorzellen umgewandelt (wenn es weniger Transformatoren gibt, können alle Produkte umgewandelt und alle Transformatoren beschichtet werden).

Identifizierung eines positiven Klons:

Kolonien können je nach Situation ausgewählt werden.PCRIdentifizierung, Extraktion von Plasmiden (Warennummer)31013-100Restriktive Enzyme-Identifizierung oder Sequenzierung durchführen.

Das One Step Seamless Cloning Kit