One Step Gibson Klonen

NoblaidOne Step Gibson Klonen

Ein Schritt Gibson Klonen Kit(1-5 Teile verbindbar)

Katalognummer:42112

Verpackungsmenge:

Produktlagerung:-20°CAufbewahren, um wiederholtes Einfrieren zu vermeiden

Beschreibung: Dieses Produkt ist nicht abhängig vonT4Verbindungsenzyme, die nicht durch den enzymatischen Schnittpunkt des Trägers und des Zielsegments eingeschränkt sind, während die Methode der Umrüstung von überlappenden Fragmenten direkt verwendet wird, können spezielle Enzymkombinationen die Träger nach einer beliebigen Methode linearisiert und mit ihren beiden Enden mit15-25bpÜberlappende GebietePCRSegment (flache End) orientierte Umstrukturierung, die schnell realisiert werden kann1-5Effizientes nahtloses Klonen eines Fragments.

Die Parameter des spezifischen Produkts hängen von den Parametern ab, die die Produktbeschreibung erhalten haben

Eigenschaften:

1. 30Eine Minute kann eine oder mehrere lange oder kurzePCRVerstärkter Abschnitt (flaches Ende) wird in den Träger eingesetzt.

2. Nicht abhängig von der Verfügbarkeit von Träger- und Insertion-Fragment-Enzym-Schnittstellen und der Trägerplane/Die Grenzen des klebrigen Endes können an jedem beliebigen Ort geklont werden.

3.Ein nahtloser Klon führt keine unerwünschten Basensequenzen durch den Einsatzpunkt.

4. Effizient, präzise und positiv95%。

Prinzipien:

Vorbereitung der Linearisierung von Trägern und Einfügung von DNA-Fragmenten:

A: Vorbereitung linearer Träger

(1). Quellen des Enzyms:Der entstandene lineare Träger, flaches Ende oder Klebstoff, Mono- oder Bi-Enzym-Schnitt, kann nach dem Enzym-Schnitt-Klebstoff zurückgewinnt werden.

Hinweis: Es gibt keine Doppelketten-DNA-Konnektase im nahtlosen Splicing- und Klonreaktionssystem und keine Träger-Selbstverbindungsreaktion. Deshalb sind auch lineare Träger, die monoenzymatisch hergestellt werden, keine endgültige Dephosphorsäurebehandlung erforderlich. Falschpositive Klone (ohne Insertionsfragmente), die nach der Transformation des Rekombinationsprodukts auftreten, entstehen durch die Transformation eines nicht linearen ringförmigen Trägers durch enzymatische Unvollständigkeit. Wir empfehlen, dass die enzymatische Rückgewinnung dieses Anteils an nicht linearen Trägern auf das maximale di reduzieren kann.

(2). Reverse PCR Quellen:Es wird empfohlen, eine hochfidelitäre DNA-Polymerase (Artikelnummer: P517-05) zu verwenden, wenn die Amplifikationsstreifen allein durch die Reinigung des PCR-Produkts (Artikelnummer: DC012-100) oder andernfalls durch die Klebstoffrückgewinnung (Artikelnummer: DC011-100) erhalten werden können.

Hinweis: Umkehrte PCR-Plasmid-Schablonen sind auch nicht-lineare Träger und können auch zu falsch positiven Klonen (ohne Insertionsfragmente) führen, so dass die Verdauung der Plasmid-Schablonen mit Dpn I-Endocytease vor der Reinigung der linearen Träger der PCR-Quelle (PCR-Produkt) den Hintergrund verringern und die positive Rate erhöhen kann. Aber im Allgemeinen ist die Rekuperation von Kleber ausreichend, um den Anteil dieser nicht-linearen Träger auf die höchste di zu reduzieren, daher empfehlen wir auch die Rekuperation von Kleber von linearen Trägern der umgekehrten PCR-Quelle.

B: Vorbereitung der Einführung von DNA-Fragmenten

(1). Entwurf eines einzelnen Einfügfragmentklonprimers: Ein Klonprimer umfasst die Einfügung segmentspezifischer Primiersequenzen und Überlappungssequenzen.

Klonen von positiven Vorläufern (5’-3’): Sequenz von überlappenden Bereichen mit linearen Trägern in Richtung 16-25 nt (ab 3’-Ende) + Sequenz von spezifischen Vorläufern in Richtung Fragmente (18-25 nt)

Umkehrtes Klonen (5’-3’): Umkehrtes 16-25 nt-Überlappungsbereich des linearen Trägers (ab 3’-Ende) + Umkehrtes Spezifisches Einfügen (18-25 nt)

Hinweis:Die Basenzahl der überlappenden Zonen muss mindestens 16 bp sein und der Tm-Wert zwischen mehreren überlappenden Zonen muss gleichbleiben und DieDie Die Die Die Tm-Werte müssen bei 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C) bleiben (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C), sonst kann die Basenzahl verlängert werden, bis die Anforderungen erfüllt sind.

Entsprechend der Struktur des linearen Trägerensendes (5 ′ hervorragend, 3 ′ hervorragend, flaches Ende) unterteilt sich das Einführungsdesign auch in 3 Fälle, wie folgt:

Die beiden Enden des linearen Trägers unterscheiden sich aufgrund der linearen Methode (z. B. Monoenzym-Schnitt, Bienzym-Schnitt, Reverse PCR), kann eine beliebige Kombination von zwei oder zwei der oben genannten drei Endstrukturen sein, das Prinzip des Einsetzens eines segmentspezifischen Primierdesigns folgt dem Prinzip des allgemeinen Primierdesigns.

Bei der Berechnung der Vergrößerungsprozidentkühlungstemperatur ist es einfach, den Tm-Wert der genspezifischen Vergrößerungssequenz zu berechnen, und die homogene Sequenz am Ende des Trägers sollte nicht an der Berechnung beteiligt sein.

Beispiel für das Design eines positiven Vorläufers (EcoR I Enzym-Schnitt):

Wie oben dargestellt, wird der Träger durch das Ecor I-Enzym geschnitten und bildet ein 5' ausgeprägtes Ende:

Gemäß dem obigen Konstruktionsprinzip können die Berechnungen vom 3'-Ende beginnen und die Rückrechnung von 16bp-25bp (in diesem Beispiel wird die gleiche Sequenz mit 20 bp-Enden überlappt) vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass der Tm-Wert des überlappenden Bereiches konsistent bleibt und bei 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C).

Die Vorrichtung ist wie folgt: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN 3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung des oben genannten Protor-Designs verschwindet der EcoR I-Enzym-Schnittpunkt (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn eine Reservierung erforderlich ist EcoR-I-Enzym-Lokalisierungspunkte, die eine fehlende EcoR-I-Identifizierung-Lokalisierungssequenz aattc zwischen der 20 bp-Überlappungssequenz am Ende des Trägers und der Zielsegment-spezifischen Primiersequenz ergänzen müssen,Nach Abschluss der Klonverbindung bleibt der EcoR I-Enzym-Schnitt vorhanden (Retention-Enzym-Schnitt).

Genau wie folgt: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Ausführungsbeispiel des Reverse-Initiator-Designs (Hind III-Enzym-Schnitt):

Wie oben dargestellt, wird der Träger durch das Hind III-Enzym geschnitten und bildet ein 5' ausgeprägtes Ende:

Gemäß dem obigen Konstruktionsprinzip können die Berechnungen vom 3'-Ende beginnen und die Rückrechnung von 16bp-25bp (in diesem Beispiel wird die gleiche Sequenz mit 20 bp-Enden überlappt) vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass der Tm-Wert des überlappenden Bereiches konsistent bleibt und bei 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C).

Die Umkehrlösung ist wie folgt: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung des oben genannten Protor-Designs verschwindet der Hind III-Schnittpunkt (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn eine Reservierung erforderlich ist Hind-III-Enzym-Lokalisierung, die fehlende Hind-III-Identifikation-Sitzsequenz agctt zwischen der 20 bp-Überlappungssequenz am Carrier-Ende und der Zielsegment-spezifischen Primiersequenz ergänzen muss ，Der Hind III-Enzym-Steg bleibt vorhanden (Retention-Enzym-Steg).

Genau wie folgt: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCA Agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

(2). Konstruktion von Klononprinzipien für mehrere Einsetzfragmente: Konstruktionsverfahren für Einsetzfragmentenprinzipien, die mit beiden Enden des Trägers verbunden sind, und Konstruktionsverfahren für Einzelstücke, die zwischen den Stücken und den Stücken verbunden sind, sind in der folgenden Abbildung dargestellt:

* Überlappungsbereich zwischen mehreren Einsetzungen gibt es zwei Möglichkeiten der oben genannten * Markierungen (blau und rot), bei Multi-Segment-Starter-Design können Sie eine beliebige Methode oder eine Mischung beider Methoden wählen, um sicherzustellen, dass es eine Überlappungsbereich von 15-25 bp zwischen dem Segment und dem Segment gibt.

(3). Auswahl des Enzyms: Es wird empfohlen, eine hochfidelitäre DNA-Polymerase oder eine PCR-Mix (Artikelnummer: P517-05 oder P814-05) zu verwenden.

(4). Reaktionsbedingungen: In der Regel können die spezifischen Polymerase-Anweisungen entsprechend durchgeführt werden.

(5). Reinigung des Einsetzsegments

lOptional:Wenn das Fragment von einer Plasmid-Schablone stammt und das Plasmid die gleiche Resistenz wie der Rekombinationsträger hat, kann die Verdauung der Plasmid-Schablone vor der Reinigung mit Dpn I-Intracetase den Hintergrund verringern und die Positivitätsrate erhöhen.

lWenn das Fragment einzeln ist, wird empfohlen, das Fragment mit einem PCR-Produkt-Reinigungskit (Artikelnummer 43012-100) zu reinigen.

lBei nicht spezifischer Verstärkung wird empfohlen, die Fragmente mit einem Klebstoff-Recyclingkit (Artikelnummer 43011-100) zu recyceln.

lMit dieser Methode zu klonen, wird der enzymatische Schnittpunkt, der zur Linearisierung des Trägers verwendet wird, beim Spleizen fehlen, wenn strenge Anforderungen an den enzymatischen Schnittpunkt vorliegen, empfohlen Achten Sie auf die Auswahl des Enzymes, wenn nötigÜberlappende Regionensequenzen von positiven Reverse-Klonen-Primären und spezifische GensequenzenErhöhen Sie die fehlenden Basen, um die ursprünglichen enzymatischen Schnittstellen wiederherzustellen (siehe die oben genannten Beispiele für positive inverse Protor-Designs).

lWenn das rekombinierte Plasmid für die Proteinexpression verwendet wird, beachten Sie bei der Gestaltung des Primärs, dass die für die Proteinexpression und Reinigung erforderlichen Sequenzen (z. B. Starter, RBS-Sequenz, Start-Codon, End-Codon, Protein-Label usw.) nicht zerstört werden.

Schritte zur nahtlosen Klonreaktion:

Hinweis: 2 × Cloning Master Mix enthält den Verbindungsverstärker PEG ist sehr klebrig, klebriger, wenn es aus dem Kühlschrank bei niedrigen Temperaturen herausgenommen wird, kann in der Hand für ein paar Minuten eingefroren werden, um die Temperatur zu erhöhen, um die Viskosität zu verringern (ohne Auswirkungen auf die Qualität), mit dem Finger das Zentrifugerboden vollständig zu mischen oder mit einem Wirbelschlag zu mischen.

1. Einrichten des Reaktionssystems gemäß der folgenden Tabelle (Herstellung bei Raumtemperatur mit PCR-Röhren möglich)

* Der Träger wird in der Regel mit 10-50 ng eingesetzt, und das Moleverhältnis zwischen dem eingesetzten Segment und dem Träger liegt am besten zwischen 2: 1 und 3: 1; Wenn das eingesetzte Segment kleiner als 200 bps ist, ist das Molenverhältnis des eingesetzten Segments zu dem Träger 5: 1 und bei mehreren Segmenten ist das Molenverhältnis zwischen dem Segment und dem Segment 1: 1.

2. Leicht mischen, auf 50°C-Reaktion für 15 Minuten (kann auf einem PCR-Instrument durchgeführt werden), nach Beendigung der Reaktion wird die PCR direkt auf Eis umgewandelt oder auf -20 gespeichert°C. Die Verbindung von mehr als 3 Segmenten kann die Reaktionszeit auf 30 Minuten verlängern.

3. Nehmen Sie 5 µl Reaktionsprodukt und verwandeln Sie es gemäß der Anleitung für die Sensorzellen (wenn es weniger Transformatoren gibt, können alle Produkte verwandelt und alle Transformatoren beschichtet werden).

Identifizierung eines positiven Klons:

Je nach Umstand kann eine Koloniale PCR-Identifizierung ausgewählt werden, um Plasmide (Artikelnummer 31011-100) für eine restriktive Intracetase-Identifizierung oder Sequenzierung zu extrahieren.

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