Molekuläre Wechselwirkungsexperimente: ChIP-Chromatin-Immunschüttung

1. Technische Einführung

ChIP (Chromatin Immune Co-Deposition) ist eine Schlüsseltechnologie zur Untersuchung der Protein-DNA-Wechselwirkungen, die weit verbreitet in der Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren und der Analyse epigenetischer Modifikationen verwendet wird.

II. Technische Grundsätze

Mit der spezifischen Bindung von Antigen-Antikörpern werden DNA-Fragmente, die an das Zielprotein gebunden sind, abgefällt, um das regulierende Protein, das an die DNA-Sequenz gebunden ist, wirklich zu reflektieren.

III. Anwendungsszenarien

Transkriptionsregulatorische Studien: Identifizierung von Transkriptionsfaktoren (z.B.DNA-Bindungsstellen von p53, NF-κB).

Epigenetik: Analyse der Histoproteinmodifikation (z.B.H3K27me3) in der genetischen Stille.

3. Krankheitsmechanismus: Erkunden Sie die Bindungsmuster von anomalen Proteinen wie MYC in Krebs.

4. Kann mitTechnologien wie qpcr und seq.

4. Technische Vorteile

ChIP erfasst die dynamische Bindung von Proteinen und DNA im realen Zustand in der Zelle durch Formaldehyd-Kreuzung, um falsche Negativitäten oder falsche Positiven in In-vitro-Experimenten zu vermeiden, insbesondere für die Untersuchung von kurzfristigen Bindungsereignissen wie Transkriptionsfaktoren.undSpezifische Antikörper könnenwiederPräzise Bereicherung von DNA-Fragmenten, die an Zielproteine gebunden sind, mit qPCR oder Sequenzierung (ChIP-seq) zur Ermittlung auf niedriger bis tausendzelliger Ebene (z. B. Optimierungskits) mit signifikanter Empfindlichkeitund eine breite Anwendbarkeit.

V. Typ der Probe

Frische Zellen (Adhesive Zellen / Suspendenzellen), Gefrorene Zellen, Gefrorene Gewebe, Vernetzte Zellproben.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 1 x 10 ^ 7 Stück (kann 1 10cm-Scheibe oder in Form von suspendierten Zellen in einer Zentrifuge oder einer T75-Flasche gelagert werden);

Gefriertes Gewebe: ca. 70 mg;

Vernetzte Zellproben: Vernetzte Zellen mit 1% Formaldehyd.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: die nähere Entfernung kann frische Zellproben in einer Platte / T75-Flasche / Zentrifugerrohr mit regulärer Temperatur Express (spätestens am nächsten Tag) transportiert werden, die Stadt kann blinken oder persönlich geliefert werden, die Entfernung kann -80 ° C gefrorene Zelltrockneis transportiert werden;

Gewebeproben & Vernetzte Zellproben: -80 ° C Gefriert Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Untersuchung mit ChIP-Antikörpern.

9. Versuchszyklus

1-2 Wochen (ohne Sequenzierung)

10. Andere

Bei der Auswahl der RT-PCR ist ein Ort für die Nachverfolgung erforderlich.

Spezifische Schritte zur Vernetzung von Formaldehyd-Zellen: 1. Fügen Sie eine endliche Konzentration von 1% Formaldehyd in die Zellschanne hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 ° C; Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem DPBS, das [1 mM PMSF, 1 μg / ml Peptidase-Inhibitor und 1 μg / ml Pepstatin A] enthält. ② Kraben Sie die Zellen in 2 ml eisgekühltes DPBS mit Protease-Inhibitoren und übertragen sie in eine Zentrifuge, um sie einzufrieren.