Molekuläre Wechselwirkungen: CUT& TAG Zielschneiden und Etikettieren

1. Technische Einführung

CUT&TAG ist eine hochempfindliche epigenomische Analysetechnologie, die auf Antikörper-geführtem gezieltem Chromatinschneiden und Etikettierung basiert. Diese Technologie überwindet die Engpässe wie niedrige Empfindlichkeit, hohes Hintergrundgeräusch und große Probenbedarf der traditionellen ChIP-seq. Sie kann Chromatinmerkmale wie Histoproteinmodifikation, Transkriptionsfaktorbindung und andere auf einzellerner Ebene analysieren.Richtung。

II. Technische Grundsätze

CUT&TAG ermöglicht eine präzise Chromatinanalyse in vier Schritten:

1. Antikörper-Zielpositionierung:Spezifische monoantibs (z. B. H3K4me3 Antikörper) binden sich an die Zielchromatinregion und Protein A/G-Biantibs tragen den Tn5 Transformase-Komplex (mit Sequenzierungsverbindungen).

2. Zielschneiden und Etikettieren:Die Tn5-Transformase führt unter Antikörper-Anleitung eine DNA-Doppelkettenschneidung des Zielchromatins durch und verbindet sie mit einem Schnittbereich von etwa 50-300 bp auf beiden Seiten der Zielstelle.

Freisetzung von DNA-Fragmenten:Protease K verdauen Chromatine, die sich kreuzen und freisetzen DNA-Fragmente mit Verbindungen.

Bibliothekenbau und Sequenzierung:PCR erweitert die Zielsegmente und erstellt eine Illumina-Sequenzierungsbibliothek mit einer Sequenzierungstiefe von ~20 Millionen Lesungen/Probe (50% weniger als ChIP-seq).

III. Anwendungsszenarien

CUT & TAG zeigt epigenetische Unterschiede in verschiedenen Subpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung auf Einzelzellebene.

Zum Beispiel:

Tri-negativer Brustkrebs: Die FOXA1-regulierten Super-Enhancers, die durch Einzelzell-CUT & TAG festgestellt wurden, werden spezifisch in basalen Subtypen aktiviert, die die Expression von Schlüsselgenen der EMT (Epithelial-Intermedial Transformation) wie SNAI1 antreiben und Metastasen fördern.

Akute Myeloleukämie: Nachverfolgung von Knochenmarkproben bei wiederkehrenden Patienten und Identifizierung dynamischer Veränderungen der H3K4me1-Modifikation in CD34+-Stammzellen, die die Entwicklung von Chemotherapie-Resistenz vorausschauen, was neue Ziele für eine seeminglich gezielte Therapie bietet.

Episkopische Reprogrammierung der Embryonentwicklung: CUT&TAG verfolgt den dynamischen Aufbauprozess der Histoproteinmodifikation in der frühen Embryonentwicklung.

Mäuse vor dem Bett Embryo: Es wurde festgestellt, dass H3K9me3 beginnt Ablagerung in der 2-Zell-Phase, bevorzugt markiert reverse Transposition-Regionen (wie LINE-1), diese Modifikation erhält die Stabilität des Genoms durch die Hemmung der Transposition-Aktivität.

5. Menschliche embryonale Stammzellen: Karte der Dynamik von H3K27ac in der Neurodifferenziation, die Identifizierung der erweiterten Subnetze der SOX2- und OCT4-Regulierung, um die Pluripotenz-Exit-Schlüsselknoten aufzuzeigen.

Immunzellenfunktionelle Regulierung: Die scheinbare Grundlage für die Analyse der Differenzierung und des funktionellen Zustands der T-Zellen.

T-Zell-Erschöpfung: In einem Modell einer chronischen Virusinfektion wurde festgestellt, dass die H3K27ac von CD8 + T-Zellen, die sich ausputzen, abnormal an PD-1- und TIM-3-Genositzen angereichert sind, die die Aktivität dieser verstärkten Sonen direkt durch den TOX-Transkriptionsfaktor reguliert werden.

8. Regulatorische T-Zellen (Treg): Kombinierte ATAC-Seq ergab, dass FOXP3 die hemmende Funktion von Treg-Zellen stabilisiert, indem er H3K4me3 modifiziert, ein Prozess, der auf die EZH2-vermittelte H3K27me3-Synergie basiert.

4. Technische Vorteile

1. Hohe Empfindlichkeit (100-zellige Detektion): Tn5-Transformase schneidet und verbindet Sequenzierungsverbindungen direkt an der Zielstelle, um zufällige Verluste durch DNA-Fragmentierung (Ultraschallbrechung) in ChIP-seq zu vermeiden. Das Signal-Rausch-Verhältnis von CUT&TAG wurde im Vergleich zu ChIP-seq um das achtfache erhöht (S/N = 12:1 vs. 1,5:1) und die Anzahl der erkannten Differenzspitzen erhöhte sich um 40%.

Einzelbasisauflösung und präzise Positionierung: Der Antikörper-Tn5-Komplex schneidet nur DNA in der Nähe der Bindungsstelle (± 50 bp), während das Ultraschallbrechen von ChIP-seq zufällige Fragmente von 200-500 bp erzeugt. In der p53-Kombinationsortsanalyse detektierte CUT & TAG einen einzelnen schmalen Spitze (Spitzenbreite ≈ 30 bp), während ChIP-seq einen breiten Spitze (Spitzenbreite ≈ 200 bp) zeigte, der sich genau auf das Zentrum der TTGCCT-Basissequenz orientiert.

Einzellige Kompatibilität mit räumlicher Epitomik: Die gemeinsame 10x Genomics-Plattform, die einzelne Zellen und Antikörper-Tn5-Komplexe in Öltropfen durch Mikrofluide umhüllt, hat eine einzigzellige H3K27ac-Kartenkonstruktion erreicht (Nature Methods, 2022).

Die neu entwickelte Spatial CUT&Tag-Technologie kann die Substrukturanverteilung von H3K4me3 auf Gewebeschnitten lokalisieren, z. B. durch die Visualisierung von Modifikationen im Zusammenhang mit der Aktivität von Hypokampusneuronen in Maus-Gehirnschnitten.

V. Typ der Probe

Frische Zellen (Adhesive Zellen / Suspendenzellen), Gefrierte Zellen, Gefriertes Gewebe.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 10.000 Stück (kann 1 Loch in einer 24-Loch-Platte sein oder in Form von suspendierten Zellen in einem Zentrifugerrohr gelagert werden);

Gefriertes Gewebe: ca. 10-20 mg.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: Frische Proben können in der Nähe zur Verfügung gestellt werden, frische Zellproben, die in Schalen / Zentrifugerrohren kultiviert werden, werden bei regulärer Temperatur (spätestens am nächsten Tag) transportiert, die in der Stadt blinken oder persönlich geliefert werden können; Entfernung, kann -80 ° C gefroren Zellen Trockeneis Transport;

Gewebeproben: -80 ° C gefroren Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Antikörper der ChIP-Klasse (wenn nicht, können auch Antikörper der IF-Klasse ausgewählt werden)

9. Versuchszyklus

1-2 Wochen (ohne Sequenzierung)

10. Andere

Nachverfolgung Rrealtime PCR/Sequenzierung