Molekulare Interaktionen: Pull-Down-Experimente

1. Technische Einführung

Das Pull-Down ExperimentAuch bekannt als Down-Experiment, ist eine in-vitro-Affinität und Reinigungstechnik.

II. Technische Grundsätze

Fixieren eines Proteins an eine bestimmte Substrat (z.B.SepharoseJedoch wird das Ligand-Protein, das mit dem Fixierprotein interagieren kann, adsorbiert, während die nicht adsorbierten "Verunreinigungen" mit der Entflüssigung fließen. Das adsorbierte Protein kann durch Änderung der Entwaschung oder der Entwaschungsbedingungen zurückgewonnen werden.

III. Anwendungsszenarien

1. Überprüfung bekannter Protein-Wechselwirkungen: Durch ein Pull-down-Experiment mit bekannten Köderproteinen und möglichen Wechselwirkungen zwischen Beute-Proteinen kann die Wechselwirkung zwischen beiden überprüft werden, wenn das Vorhandensein von Beute-Proteinen nachgewiesen wird.

2. Screening unbekannter Protein-Wechselwirkungen: Durchführen Sie Pull-down-Experimente mit Köderproteinen und Zellalysaten oder anderen Proteinmischungen und identifizieren Sie das gebundene Protein, um unbekannte Proteine zu screenen, die mit Köderproteinen interagieren.

Untersuchung der Zusammensetzung des Proteinkomplexes: Der Proteinkomplex wird durch ein Pull-down-Experiment isoliert und dann das Protein im Komplex identifiziert, um die Zusammensetzung des Proteinkomplexes zu bestimmen.

Studie der Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkung: Mit der DNA Pull-down und RNA Pull-down-Technologie können die Wechselwirkungen zwischen Protein und DNA und RNA untersucht werden, wie die Bindung von Transkriptionsfaktoren und Promotoren, die Bindung von RNA-bindenden Proteinen und RNA.

4. Technische Vorteile

Es kann festgestellt werden, ob das Zielprotein und das Testprotein direkt interagieren können.

V. Typ der Probe

Frische Zellen (Klebstoffzellen / Suspensionszellen), Gefrierzellen, Gefriergewebe, Lysatproben.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 5 x 10 ^ 6 Stück (es können 2 6 cm-Scheiben sein oder in einer Zentrifuge in Form von suspendierten Zellen oder 2 T25-Flaschen gelagert werden);

Gefriertes Gewebe: ca. 40 mg;

Lysatprobe: Proteinkonzentration nicht weniger als 2 mg / mg, Proteinmenge nicht weniger als 3 mg.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: in der näheren Entfernung können frische Proben zur Verfügung gestellt werden, werden frische Zellproben in Schalen / T25-Flaschen / Zentrifugerrohren kultiviert werden, die mit Express-Temperatur (spätestens am nächsten Tag) transportiert werden, die Stadt kann blinken oder persönlich geliefert werden, die Entfernung kann -80 ° C gefrorene Zelltrockneis transportiert werden;

Gewebeprobe & Kläckenprobe: -80 ° C Gefriert Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Bei WB-Tests müssen entsprechende Antikörper bereitgestellt werden.

9. Versuchszyklus

3-4 Wochen (ohne Massenspektrum)

10. Andere

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， Spezifisch muss die Gattung und das Zielprotein informiert werden, nachfolgende Western Blot / Protein-Massenspektrumprüfungen durchgeführt werden, und die in vitro-Expressionskosten für Fusionsproteine müssen auf der Grundlage der individuellen Bewertung des spezifischen Zielproteins berechnet werden.

Einige Experimente mit Transkriptionsfaktoren können auch rekombinierte Expression von Proteinen verwenden.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 1 x 10 ^ 7 Stück (kann 1 10cm-Scheibe oder in Form von suspendierten Zellen in einer Zentrifuge oder einer T75-Flasche gelagert werden);

Gefriertes Gewebe: ca. 400 mg;

Pflanzengewebe: ca. 2 g; Zytonuklein, Reinigungstranskriptionsfaktor, rekombinantes Expressionsprotein usw.: liefert mindestens 50 µl pro Membran in einer Konzentration von nicht weniger als 0,5 mg/ml.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: die nähere Entfernung kann frische Zellproben in einer Platte / T75-Flasche / Zentrifugerrohr mit regulärer Temperatur Express (spätestens am nächsten Tag) transportiert werden, die Stadt kann blinken oder persönlich geliefert werden, die Entfernung kann -80 ° C gefrorene Zelltrockneis transportiert werden;

Gewebeproben & andere Flüssigkeitsproben: -80 ° C Gefriert Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Binden Sie proteinspezifische Antikörper über 50 µl, Konzentrationen größer als 0,5 mg/ml.

9. Versuchszyklus

2-3 Wochen

10. Andere

Sondensequenzen Wenn keine Sondensequenzen vorhanden sind, geben Sie Informationen oder Literatur über DNA-Bindungsproteine an.