Molekuläre Wechselwirkungen Experimente: CLIP UV-Collagen-Immunosedimentation

1. Technische Einführung

CLIP (Vernetzende Immunopräzipitation) 交联Immunisierung(durch Kombination)UV VernetzungImmun und Co-sedimentation Methoden zur Analyse der Bindungsstellen von Protein-RNA-Interaktionen.

II. Technische Grundsätze

Die CLIP-Technologie nutzt UV-Strahlung, um die RNA in der Zelle mit dem RNA-bindenden Protein (RBP) kovalente Vernetzung zu erzeugen, die anschließend durch die Methode der Immunosedimentation an RNA-Fragmente angereichert wird, die an ein bestimmtes RBP gebunden sind, und die Informationen über die RNA-Bindungsstellen und Bindungssequenzen von RBP im Körper nach Schritten wie Reverztranskription und High-Flow-Sequenzierung erhalten.

III. Anwendungsszenarien

Studie der Protein-RNA-Wechselwirkung: Bestimmung der RNA-Bindungsstellen und Bindungssequenzen bestimmter Proteine im Körper, um den Mechanismus der Rolle von Proteinen bei der Posttranskriptionsregulierung aufzudecken.

Krankheitsbezogene Studien: Durch den Vergleich der RNA-Bindungen von RBP in normalen und kranken Zuständen wurden RNA-Bindungsereignisse und regulatorische Netzwerke festgestellt, die mit dem Auftreten und der Entwicklung der Krankheit zusammenhängen.

3. Arzneimittelentwicklung: Bereitstellung neuer Ziele und Wirkungsmechanismen für die Arzneimittelentwicklung, um die Entwicklung von Arzneimitteln gegen spezifische RNA-bindende Proteine oder ihre regulierten RNA-Moleküle zu unterstützen.

4. Bioinformatische Analyse: Durch die bioinformatische Analyse der CLIP-seq-Daten wird der Bindungsort und das Bindungsmuster des RNA-bindenden Proteins vorhergesagt, ein RNA-Regulationsnetzwerk usw. aufgebaut.

4. Technische Vorteile

In vitro Detektion: Fähigkeit, die Interaktion von Proteinen und RNA in lebenden Zellen zu erfassen, die den physiologischen Zustand des Körpers widerspiegelt.

Hohe Spezifizität und strenge Reinigung: Durch die Reinigung von vernetzten Komplexen durch spezifische Antikörper oder Etiketten können nicht spezifisch gebundene RNA und Proteine effektiv entfernt werden und die Glaubwürdigkeit der Ergebnisse verbessert werden.

3. Kombinierte Sequenzierung mit hohem Durchsatz: In Kombination mit der Sequenzierungstechnologie mit hohem Durchsatz können die RNA-Bindungsstellen und Bindungssequenzen von RBP genomweit identifiziert werden, um umfangreiche Informationen zu erhalten.

V. Typ der Probe

Frische Zellen (klebende Zellen / suspendierte Zellen), UV-Kreuzzellen nach Proben.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 1 x 10 ^ 7 Stück (kann 1 10cm-Scheibe oder in Form von suspendierten Zellen in einer Zentrifuge oder einer T75-Flasche gelagert werden);

Vernetzte Zellprobe: 254 nm, 150 mJ / cm² Standard UV-Vernetzte Behandlung Zellen.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: In der Nähe können frische Zellproben, die in Schalen / T75-Flaschen / Zentrifugerrohren aufbewahrt werden, mit Express-Temperatur (spätestens am nächsten Tag) transportiert werden, die in der Stadt blinken oder persönlich geliefert werden können;

Zellproben nach Vernetzung: -80 ° C Gefriert Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Untersuchung mit ChIP-Antikörpern.

9. Versuchszyklus

1-2 Wochen (ohne Sequenzierung)

10. Andere

Bei der Auswahl der RT-PCR ist ein Ort für die Nachverfolgung erforderlich.