Molekulare Interaktionen: RIP (RNA Immunosedimentation)

1. Technische Einführung

Die RIP-Technik (RNA Immunoprecipitation, RNA Immunoprecipitation) ist eine kritische experimentelle Methode zur Untersuchung der Interaktion zwischen RNA und Proteinen in einer Zelle, die die Funktionsmechanismen von RNA-Bindenproteinen (RBP) bei der Posttranskriptionsregulation aufdecken kann.

II. Technische Grundsätze

RIP setzt den entsprechenden RNA-Proteinkomplex unter Verwendung von Antikörpern gegen das Zielprotein ab und macht die Ergebnisse biologisch überzeugender durch Isolierung, Reinigung, RT-PCR-Validierung oder Sequenzierung der an den Komplex gebundenen RNA.

III. Anwendungsszenarien

Basismechanismus: Analyse der Funktion von RNA-bindenden Proteinen (wie AGO2, Polycomb-Komplexe) und RNA-Regulationsnetzwerke.

Krankheitsstudien: Vergleichen Sie die Unterschiede in der RNA-Protein-Interaktion zwischen der Krankheit und der normalen Probe und finden Sie potenzielle Biomarker (z. B. Krebsverwandte lncRNA).

Medikamentenentwicklung: Bewertung der Wirkung von Medikamenten auf die RNA-Protein-Wechselwirkung und Beschleunigung des Zielscreenings.

4. Technische Vorteile

Höhere Empfindlichkeit: Eine schwache Interaktion zwischen RNA und Proteinen in niedriger Fülle kann nachgewiesen werden.

Breiter Dynamikbereich: Von einer kleinen Anzahl von Zellen (z. B. 5 x 107) bis hin zu komplexen Gewebeproben.

Multiomik-Kombination: Kombinieren Sie RNA-Seq, CLIP-Seq oder ChIP-Seq, um ein multidimensionales Regulationsnetzwerk aufzubauen.

V. Typ der Probe

Frische Zellen (Adhesive Zellen / Suspendenzellen), Gefrorene Zellen, Gefrorene Gewebe, Vernetzte Zellproben.

6. Probenbedürfnisse

Zellproben: ca. 1 x 10 ^ 7 Stück (kann 1 10cm-Scheibe oder in Form von suspendierten Zellen in einer Zentrifuge oder einer T75-Flasche gelagert werden);

Gefriertes Gewebe: ca. 70 mg; Vernetzte Zellprobe: Vernetzung der Zellen mit 1% Formaldehyd.

Probenvorbereitung & Transport

Lebende Zellproben: die nähere Entfernung kann frische Zellproben in einer Platte / T75-Flasche / Zentrifugerrohr mit regulärer Temperatur Express (spätestens am nächsten Tag) transportiert werden, die Stadt kann blinken oder persönlich geliefert werden, die Entfernung kann -80 ° C gefrorene Zelltrockneis transportiert werden;

Gewebeproben & Vernetzte Zellproben: -80 ° C Gefriert Trockeneis Transport.

8. Die zur Verfügung gestellten Reagenzien

Untersuchung mit ChIP-Antikörpern.

9. Versuchszyklus

1-2 Wochen (ohne Sequenzierung)

10. Andere

Bei der Auswahl der RT-PCR ist ein Ort für die Nachverfolgung erforderlich.

Spezifische Schritte zur Vernetzung von Formaldehyd-Zellen: 1. Fügen Sie eine endliche Konzentration von 1% Formaldehyd in die Zellschanne hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37 ° C; Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem DPBS, das [1 mM PMSF, 1 μg / ml Peptidase-Inhibitor und 1 μg / ml Pepstatin A] enthält. ② Kraben Sie die Zellen in 2 ml eisgekühltes DPBS mit Protease-Inhibitoren und übertragen sie in eine Zentrifuge, um sie einzufrieren.