Bifluorescenase-Bericht-Gen-Test-Kit

Firefly und Renilla Assay KitBifluorescenase-Bericht-Gen-Test-KitMit dem DLR-Test können die Aktivitäten von Firefly Luciferase und Renilla Luciferase in einer einzelnen Probe nacheinander nachgewiesen werden. Zuerst mit Luciferin (Luciferin) als Substrat, um die Aktivität der Glühfeuerfluorensase zu erkennen, und dann mit Substanzen, die die Glühfeuerfluorensase-Katalyse hemmen, und gleichzeitig mit Coelenterazine (Coelenterazine), um die Aktivität der Marine-Nierenfluorescentase zu erkennen, um den Gen-Test der Dualfluorensase-Berichterstattung zu erreichen. Durch das Bioluminescenzsystem der Fluorensase und ihrer Substrate kann die Genexpression sehr empfindlich und effizient nachgewiesen werden. Normalerweise werden die transkriptionsregulierenden Komponenten oder die 5'-Starter-Subzone des interessierten Gens oben zur Luciferase klont oder die 3'-UTR-Zone nachgelagert zur Luciferase klont, um das Reporter-Gen-Plasmid aufzubauen und die Zellen zu transfizieren, um die Zellen mit geeigneten Medikamenten zu behandeln, um die transkriptionsregulierenden Wirkungen der Medikamente auf das Ziel-Gen zu bestimmen, indem die Fluorensate-Aktivität festgestellt wird. Marine Nierenfluorescenase wird häufiger als interne Parameter zur Erkennung der Transfektionseffizienz verwendet, um Unterschiede in der Zellzahl und der Transfektionseffizienz zu beseitigen.
Fluorescenase ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 61 kD, das unter Bedingungen der Anwesenheit von ATP, Magnesiumionen und Sauerstoff das Fluorescenz zu Oxyluciferin katalysiert, das während der Oxidation des Fluorescenzes ein Lichtsignal erzeugt. Marine-Nierenfluorescenase ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von ca. 36 kD, das unter Anwesenheit von Sauerstoff die Oxidation von Enterinum in Coelenteramid katalysiert, das auch während der Oxidation von Enterinum ein Lichtsignal erzeugt. Das Lichtsignal dieses Kits kann mit einem Chemikalien-Leuchtgeber, einem Enzym-Marker oder einem Fluid-Flash-Detektor gemessen werden. Das Kit verfügt über schnelle Erkennung, hohe Empfindlichkeit, einen breiten Erkennungsbereich und keine interferenz mit der zellulären Aktivität.
Eigenschaften:
Schnell: Die Zellklyse wird innerhalb von 10-15 min abgeschlossen.
Praktisch: Die Reagenzien sind einfach zu verarbeiten und die Probentests sind einfach.
Empfindlichkeit: Fähigkeit Zui Low 10 zu erkennen-20Mol der Fluorenzase.
Die Konzentration des Enzyms kann linear bis zu acht Größengruppen betragen.
Produktzusammensetzung:

1. Zellen auflösen
(1) Entfernen Sie das Medium und fügen Sie PBS vorsichtig zweimal zu waschen (klebende Zellen können diese Operation direkt durchführen, die suspendierten Zellen müssen die Zellen zentrifugieren). Fügen Sie 1 x Lyse-Puffer wie folgt hinzu (verdünnen Sie Komponente A mit sterilem Wasser 4: 1 drücken) und legen Sie die Platte auf einem Mikro-Oscillator für 15 min bei Raumtemperatur zu schütteln, um die Zellen vollständig zu spalten.
Hinweis: Das Krakprodukt kann 6 h bei Raumtemperatur gelagert werden, -70 ° C kann langfristig gelagert werden (das Krakprodukt kann nicht wiederholt gefriert werden).
(2) Zentrifugieren Sie das Produkt von 10.000-15.000 U/min in 3-5 min, und nach der Zentrifugierung wird die Oberflüssigkeit in ein neues EP-Rohr zur Nachprüfung gebracht.
Hinweis: Die Zellen können sofort nachgewiesen werden, oder sie können gefroren und bei Bedarf nachgewiesen werden. Die eingefrorene Probe muss zur Prüfung auf Raumtemperatur geschmolzen werden.
2. Arbeitsflüssigkeit
(1) Alle Komponenten auf Raumtemperatur zurücksetzen.
(2) Die Komponente C mit Komponente B vollständig gelöst und zu einer Arbeitsflüssigkeit von 0,2 mg/mL von Glühfeuerfluorenlase zusammengesetzt.
Hinweis: Fluorescentase-Arbeitsflüssigkeit kann nicht wiederholt gefriert werden, wenn die einzelne Versuchsdosis geringer ist, wird empfohlen, die einzelne Verwendung in kleine Spezifikationen aufzuteilen.
(3) Die Komponente E wird mit der Komponente D in eine Marine-Nierenfluorescenase-Arbeitsflüssigkeit verdünnt, wobei die Komponente E mit 1 µl in 49 µL der Komponente D verdünnt wird.
Hinweis: Marine-Nierenfluorescenase-Arbeitsflüssigkeit muss bereits verfügbar sein.
3. Chemische Leuchtwertprüfung
(1) Entsprechen Sie der Bedienungsanleitung für das Gerät, öffnen Sie das Gerät mit der Erkennung der chemischen Luminescenzfunktion, wie ein multifunktionales Enzym-Calibrator, stellen Sie die Parameter ein, die Messzeit beträgt 10 s und das Messintervall beträgt 2 s.
(2) Nehmen Sie bei jeder Probenmessung eine Probe von 20-100 µl ab (fügen Sie 100 µl hinzu, wenn die Probengröße ausreicht; wenn die Probengröße nicht ausreicht, kann die Dosis angemessen reduziert werden, aber die Probenlöchermenge muss konsistent bleiben). Der 1×Lysis Buffer ist ein leerer Kontrol.
(3) Fügen Sie 100 ul Fluorescentase-Testflüssigkeit hinzu, um den Wert der RLU (relative Lichteinheit) zu bestimmen (es wird empfohlen, den Enzymskalarer zu schütteln).
Hinweis: Da diese Leuchtkraft momentan leuchtet, wird empfohlen, sofort nach der Zugabe von Leuchtfeuerfluorenlase-Arbeitsflüssigkeit zu prüfen.
(4) Fügen Sie 100 ul Marine-Nierenfluorescenase-Arbeitsflüssigkeit hinzu, um den Wert der RLU (relative Lichteinheit) zu bestimmen (es wird empfohlen, den Enzym-Skalierer für die Shaking-Mischfunktion einzustellen).
(5) Unter Berücksichtigung der Marine-Nierenfluorescentase wird der mit Leuchtfeuerfluorenfluorescentase ermittelte RLU-Wert durch die von Marine-Nierenfluorescentase ermittelte RLU-Wert geteilt. Abhängig von den erhaltenen Verhältnissen, um den Grad der Aktivierung der gemeldeten Gene zwischen verschiedenen Proben zu vergleichen. Ähnliche Berechnungen können auch durchgeführt werden, wenn die Fluorescenase von Glühfeuern verwendet wird.

-20 ° C aufbewahren. Für die Komponente C wird empfohlen, steriles Wasser für eine Lagerung von 2 mg/ml, die Komponente B, die Komponente D und die Komponente C für eine Lagerung vorzubereiten.
Kleine Mengen nach den experimentellen Anforderungen verteilen. Es wird empfohlen, alle Prüfflüssigkeiten jetzt zu verwenden, um wiederholte Gefrierschmelzen zu vermeiden.

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