Schnelle Extraktion von Virusgenomen-DNA/RNA

Eigenschaften:

PCRGrundlagen und Vorsichtspunkte?

I. Experimentelle Prinzipien

PCRKünstliche selektive Vergrößerung in vitro.Die DNAEine Methode, die dem Organismus ähneltDie DNAdie Kopie. Im biologischen KörperDie DNAKopieren braucht Vorlagen, Vorlagen,Die DNAPolymerase,Die DNADesylase,dNTPsund außerhalb des Körpers;PCRDie Reaktion erfordert ebenfalls ähnliche Komponenten, Vorlagen, Vorläufer,PCR-Puffer、TaqEnzyme,dNTPs. Wo die Vorläufer eine bestimmte Sequenz sind, die künstlich entworfen wurde, um eine Verstärkung an einer bestimmten Position zu erreichen;PCR-PufferBereitstellung einer Pufferumgebung für Reaktionen; Der Reaktionsprozess ist ähnlich wie im Organismus.Die DNADie Doppelkette öffnet sich, die Vorläufer verbinden die Vorlage und erweitern sich zu einer neuen Kette. Diese Prozesse erfolgen im Organismus.Die DNADie Entkettung der Helylase erfolgt während in vitro durch die Kontrolle der Reaktionstemperatur. Wie üblich94℃Transgender VorlagenDie DNAÖffnen Sie die doppelte Kette, binden Sie den Einführungsstoff an die Schablone bei der Ausbrenntemperatur und schließlich in72℃Abschließen Sie die Erweiterung und wiederholen Sie diesen Vorgang, um bestimmte Segmente zu erreichenDie DNAerhebliche Erweiterung. Erst am Beginn des dritten Zyklus entstehen und das ZielDie DNADer gleiche BereichDie DNAMoleküle, die das Ziel weiter zyklisch erzeugenDie DNADer Index verdoppelt sich.

Später in der Erweiterung,Aufgrund der Akkumulation von Produkten,Die ursprünglich exponentiell vergrößerte Reaktion in eine flache Kurve verwandeln,Das Produkt steigt nicht mehr mit der Zykluszahl,Dies nennt man Plattform-Effekt. Plattformdauer(Plateau)Dies führt dazu, dass die niedrigen Konzentrationen von nicht spezifischen Produkten, die ursprünglich durch Fehlversammlungen entstanden sind, weiterhin erheblich zu erhöhen und höhere Werte zu erreichen. Daher sollte die Anzahl der Zyklen angemessen angepasst werden, um die Reaktion vor der Plattformperiode zu beenden und das nicht spezifische Produkt zu reduzieren. Ankunftszeit der Plattform(Plateau)Die Anzahl der erforderlichen Zyklen hängt von der Kopie der Vorlage in der Probe ab.

II. Hauptbestandteile

1.Vorlagen können in verschiedenen Formen sein, hauptsächlich einschließlich GenomeDie DNA, PartikelDie DNAGenome, die Viren tragenDie DNA、PCRProdukte,cDNAWarten, aber nicht fürdie RNAFür verschiedene Typen von Vorlagen unterscheiden sich die Vorherstellungszeiten und die Anzahl der Vorlagen. Allgemein für große GenomeDie DNAPrädiktive Zeit10 MinutenGenug, Plasma.DNA2minGenome, die Viren tragenDie DNAPräventivität2 Minuten、PCRProduktpräventivität2 MinutenGanz gut.

AchtungcDNAFür eine KetteDie DNAAber immer noch möglich.PCRDie Schablone, nur wenn in der ersten Runde der Zyklus nur ein Vorläufer verbindet, synthetisiert eine andere Kette. Ab Beginn der zweiten Runde werden beide Vorläufer mit spezifischen Stellen kombiniert, wodurch eine regelmäßigePCRdie Gleise. Gleiches wie eine Kette.die RNAAber nicht möglich.PCRDie Erweiterung liegt in der RealisierungPCRDie Reaktion istDie DNAPolymerase, nur gezielt identifiziertDie DNAKetten.

2.In Bezug auf die Anzahl der Vorlagen ist im Allgemeinen25ulSystemDie DNAQualität für50100ngFür das GenomDie DNAAufgrund seiner komplexeren Struktur ist die Konzentration der Extraktion auch häufig größer, um zu verhindern, dass die Konzentration zu groß ist.PCRAuswirkungen haben, so dass die ExtraktionDie DNAGradientelle Verdünnung durchführen. Ansonsten kann eine zu hohe Konzentration zu einer unspezifischen Verstärkung führen. Für die Partikel undPCRDas Produkt muss aufgrund seiner einfachen Struktur und der in der Regel niedrigeren Extraktionskonzentration nicht verdünnt werden.

PCRWas sollten Sie im Experiment beachten??

keinCTWerte

Testergebnisse nicht gefundenCtWertsituationen,Prüfen Sie, ob folgende Probleme auftreten:

1Nicht ausreichend Zyklen(Normalerweise nicht mehr als45Schleife,Nicht nur der Hintergrundwert,Auch die Quantität nicht erlaubt.);

2、PCRFehler bei Programmeinstellungen,Der Schritt zur Erkennung des Fluoreszenzsignals ist falsch. allgemeinSGGesetzliche Annahme72℃Sammlung bei Erweiterungvon TaqManDas Gesetz erfasst in der Regel das Signal am Ende oder bei der Verlängerung des Brennens,Eine zusätzliche Fluoreszenzaufnahme ausgewählt;

3Abbau von Proben oder Proben. DurchgängigSeiteElektrophoresis zur Erkennung der Abbau von Vorläufern und Sonden;

4Schablonenmenge kann sich abbauen oder nicht ausreichend(Nicht mehr500ng,Entsprechend der Kit-Anleitung),Proben mit unbekannten Konzentrationen sollten mit der höchsten Konzentration der Serienverdünnungsprobe beginnen;Wenn die Vorlage zerstört wird,Die Einführung von Verunreinigungen in die Probenbereitung und wiederholtes Gefrierschmelzen sind zu berücksichtigen.,Es wird empfohlen, die Vorlagenprobe in kleinen Mengen aufzuteilen,Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren;

5Ist die Startsonde geeignet?(Insbesondere die Vorläufer überqueren die Inneren.,Um sicherzustellen, dass das Genom vergrößert wirdDNA;Auf- und AbfahrtTmWert übersteigt4℃Dies wirkt sich auch auf die Erweiterung aus.)。

CTEs ist zu spät wert.

In relativer Quantitätund CtDer Wert wird in der Regel kontrolliert1525Besser zwischen.,Wenn in absoluter Menge,Proben für eine geringe Anzahl von Kopien,CtDer Wert steigt,Aber in der Regel nicht überschreiten.40Schleife,Ansonsten ist die Quantität ungenau.

daher,UrteilCtIst ein zu spät auftretender Wert ungewöhnlich,Es muss nach spezifischem Design und Zweck des Experiments durchgeführt werden.

1Die Effizienz der Erweiterung ist gering. Unsachgemäßes Verhältnis zwischen oder zwischen der Probe und der Probe,Optimierung erforderlich;Unvernünftiges Design der Probe oder Probe,Neugestaltung erforderlich;

2、PCRVerfahren nicht geeignet,Drei Schritte Reaktion,Oder optimale Abbrennung/Erweiterte Temperatur,Die Brenntemperatur kann angemessen gesenkt werden;Abfeuern/Kurze Verlängerungszeit(Es kann unter den empfohlenen Zeitbedingungen verlängert werden.10s);

3、MgCl2Ungerechte Konzentration,Erhöhung der Magnesiumkonzentration usw.PCRMangel an Abbau oder Probenahme verschiedener Reaktionskomponenten;

4、PCRDas Produkt ist zu lang.PCRProduktdesign übersteigt500bp;

5Inhibitoren in der Vorlage. Mit einer hochreinen VorlagePCRSchablonen zu erkennen oder zu verdünnen.

Produkte, die das Unternehmen verkauft: