Warennummer：B1013/4/5/6

Lagerbedingungen-20 ° C Lagerung, Komponente A muss vor Licht geschützt werden, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden.

Produktkomponenten：

Produkteinführung

Ein bemerkenswertes Merkmal der Apoptose ist der Abbau der zellulären Chromosomen-DNA, der sehr spezifisch und regelmäßig ist, was zu einer ganzen Zahl von 180 bp-200 bp verschiedener Längen von DNA-Fragmenten führt, die sich in einer spezifischen Ladder-Diagramm in der Gelelektrophoresis von Ionase zeigen. Dieses Kit verwendet die TUNEL-Methode zur Anwendung der terminalen Deoxynucleotidyltransferase (TdT) durch 3´-OH-Katalyse, die DNA in apoptotischen Zellen brecht, um YF zu integrieren. ®/ Cy-dUTP，YF ®/ Die Cy-dUTP-gekennzeichnete DNA kann direkt mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet oder mit einem Flow-Zytometer quantifiziert werden. Mit der TUNEL-Methode können apoptotische Zellen selektiv erkannt werden, anstatt Zellen, die durch Strahlung oder Medikamente zerstört sind oder die durch die Strahlung oder Medikamente zerstört sind. Markierte dUTP (z. B. Gaoxin-dUTP, Raw Wuxin-dUTP) können direkt in situ getestet werden und sind ein schnelleres und direkteres Detektionsmittel.

Diese Kit ist vielfältig anwendbar und kann zur Erkennung von Apoptose in gefrorenen oder Paraffinscheiben sowie zur Erkennung von Apoptose in gekultivierten oder suspendierten Zellen verwendet werden. Die selektive Erkennung von apoptotischen Zellen anstatt von Zellen, die durch Strahlung und Medikamente verursacht wurden, die in der DNA-Kette gebrochen sind. Diese Kit erkennt Apoptose, dauert kurze Zeit, erfordert nur einen Schritt Färbung Reaktion, kann nach dem Waschen nachgewiesen werden.

Gebrauchsanweisung

Versuchsmaterial (eigenes)

PBS-Puffer (pH ~ 7,4)

0,4 % Triton X-100 (PBS-Formulierung)

0,1% Triton X-100 (PBS-Formulierung mit 5 mg/mLBSA)

4% Polyformaldehyd (PBS-Formulierung)

Immunologischer Stift

Entwachselösungsmittel (Paraffinscheibenprobe)

Reagenzien zur Behandlung von Paraffinschneiden

Anti-fluoreszierende Löschtabletten

ddH2O

Experimentales Design

A. Positive Kontrolle

Die DNaseI-Behandlung bereitet positive Kontrollaufnahmen vor. DNase I kann verdauen Einzel- oder Doppelkette DNA ausgesetzt 3'-OH-Enden, die menschliche Apoptose verursachen. Jedes Experiment kann einmal durchgeführt werden. (zur Überprüfung des Problems mit diesem Experiment und dem Kit)

B. Negative Kontrolle

Verwendung ohne TdT Der Enzym-Tunnel Reaktion Buffer， Ersetzen Sie TdT durch ddH2O Enzyme。 (Hauptsächlich die Ausschluss von nicht spezifischen Färbungen, die durch die Apoptose der Zelle, den Operationsprozess und andere Ursachen verursacht werden, sowie die Anpassung der Belichtungsintensität der Aufnahmen.)

C. Experimentelle Behandlungsgruppe

Die Versuchsgruppe arbeitet nach den Anweisungen.

D. Experimentelle Kontrollgruppe

Die Versuchsgruppe arbeitet nach den Anweisungen.

Experimentelle Schritte

1. Probenvorbereitung:

(1) Für Wandzellen oder Zellbeschichtungen

1. PBS reinigen.

Hinweis: Wenn Sie sich Sorgen machen, dass die Zellen des Zellstricks nicht fest kleben, können Sie die Probe trocknen, um die Zellen fest zu kleben.

b. Fixierung: Hinzufügen einer angemessenen Menge von 4% Polyformaldehyd (PBS-Formulierung), 4 ° C fixiert 30 min. PBS zweimal reinigen.

c. Durchlässigkeit: Zugabe einer angemessenen Menge von 0,4% TritonX-100 (PBS-Formulierung), Raumtemperatur durchlässigkeit 20min. PBS zweimal reinigen.

Schritt 2: Tunnelreaktion.

(2) Für suspendierte Zellen oder Zellsuspensionen

a. Sammlung von Zellen (3-5 x 10)⁶1 Zelle), 1000 rpm Zentrifuge 5min, PBS reinigen 2 mal.

b. Fixierung: Fügen Sie eine angemessene Menge von 4% Polyformaldehyd (PBS-Formulierung) vollständig resuspendiert Zellen, 4 ° C fixiert für 30 min. 2000 rpm Zentrifuge 5min, PBS-Reinigung 2 mal.

c. Durchlässigkeit: Zugabe einer angemessenen Menge von 0,4% TritonX-100 (PBS-Formulierung), Raumtemperatur durchlässigkeit 20min. 2000 rpm Zentrifuge 5min, PBS-Reinigung 2 mal.

Schritt 2: Tunnelreaktion.

(3) Paraffingewebe schneiden

a. Legen Sie die Paraffinscheiben auf den Scheibenhalter und geben Sie die Scheiben 60 min in einem Ofen bei 60 ° C.

b. Entwachsen und Hydrieren: Die Schnittprobe in der Reihenfolge in Dimethyl I (10 min) Dimethyl II (10 min) 100% Ethanol I (5 min) 100% Ethanol II (5 min) 95% Ethanol (5 min) 90% Ethanol (5 min) 80% Ethanol (5 min) 70% Ethanol (5 min) ddH2O spülen 5 min, 2 Mal spülen.

Hinweis: Diphthenil ist giftig und leicht flüchtig, tun Sie dies bitte im Ventilationsschrank.

c. Filterpapier, um die Flüssigkeit um die Schnittprobe zu saugen, mit der Immunosynthese-Stift, um eine gute Probenkontur zu verwenden, um den Durchgang und die Markierung zu ermöglichen.

Hinweis: Wenn der Kontur des Immunhistochemischen Stifts während der nachfolgenden experimentellen Operationen beschädigt wurde, muss eine rechtzeitige Malerei erfolgen.

d. Durchlässigkeit: In einem Verhältnis von 1: 50 verdünnen Sie 2 mg / ml Proteinase K-Lösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 40 µg / ml, tropfen Sie 100 µL auf jede Probe, so dass die Lösung den gesamten Probenbereich abdeckt und inkubieren Sie bei 37 ° C für 30 Minuten.

Hinweis: Proteinase K durchdringt die Zellmembran und die Nukleomembran, wodurch das Färbungsreagens der nächsten Schritte vollständig in den Zellkern reagiert und die Markierungseffizienz verbessert wird. Zu lange Inkubationszeiten erhöhen das Risiko, dass Gewebeschneiden in den nachfolgenden Waschstufen von der Trägerplatte fallen, und zu kurze Inkubationszeiten können zu einer unzureichenden Durchlässigkeitsbehandlung führen und die Markierungseffizienz beeinträchtigen. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, müssen die Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur von Proteinase K je nach Gewebeprobenart optimiert werden.

e. Eintauchen Sie die Schnittprobe dreimal in 1 x PBS, jeweils 5 Minuten, saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier ab und legen Sie die behandelte Probe in der nassen Box, um feucht zu bleiben.

Hinweis: In diesem Schritt muss die Proteinase K gereinigt werden, sonst wird die anschließende Markierungsreaktion stark beeinträchtigt.

Schritt 2: Tunnelreaktion.

(4) Gefriertes Gewebe

a. Fixieren: Entfernen Sie das gefrorene Stück und erhitzen Sie es auf Raumtemperatur. Die Schnittprobe wird in 4% Polyformaldehyd (PBS-Formulierung) eingetaucht und 30 min bei Raumtemperatur festgelegt. Tauchen Sie die Schnittprobe in 1 x PBS dreimal, je 10 min.

Hinweis: Wenn Sie Sorgen haben, dass Formaldehyd nicht sauber ist, beeinflusst es den endgültigen Färbungseffekt. Nach Beendigung der Formaldehydfixierung kann eine angemessene Menge von 2 mg / ml Glycansäure für 10 min gereinigt werden, die verbleibende Fixierungslösung neutralisiert und anschließend mit PBS gereinigt werden.

b. Filterpapier, um die Flüssigkeit um die Schnittprobe zu trocknen, mit einem Immunosynthetischen Stift, um eine gute Probenkonfiguration zu verwenden, um durch und markieren zu können.

Hinweis: Wenn der Kontur des Immunhistochemischen Stifts während der nachfolgenden experimentellen Operationen beschädigt wurde, muss eine rechtzeitige Malerei erfolgen.

c. Durchlässigkeit: In einem Verhältnis von 1: 50 verdünnen Sie 2 mg / ml Proteinase K-Lösung mit PBS auf eine Endkonzentration von 40 µg / ml, tropfen Sie 100 µL auf jede Probe, so dass die Lösung den gesamten Probenbereich abdeckt und inkubieren Sie bei 37 ° C für 20 min.

Hinweis: Proteinase K durchdringt Zellmembranen und Nukleomembranen, wodurch die nachfolgenden Schritte der FärbungsmittelVollständig in den Zellkern reagieren, um die Markierungseffizienz zu verbessern. Zu lange Inkubationszeiten erhöhen das Risiko, dass Gewebeschneiden in den nachfolgenden Waschstufen von der Trägerplatte fallen, und zu kurze Inkubationszeiten können zu einer unzureichenden Durchlässigkeitsbehandlung führen und die Markierungseffizienz beeinträchtigen. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, müssen die Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur von Proteinase K je nach Gewebeprobenart optimiert werden. Wenn die Optimierung der Proteinase K-Konzentration und der Inkubationszeit noch nicht die Färbung verbessern kann, können Sie die Probe in 1% Triton X-100 (PBS-Formulierung) eintauchen und 3-5 min durch Raumtemperatur auslösen; Anschließend tauchen Sie die Schnittprobe dreimal in 1 x PBS und spülen Sie sie jeweils 5 Minuten.

d. Eintauchen Sie die Schnittprobe dreimal in 1 x PBS, jeweils 5 Minuten, saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier ab und legen Sie die behandelte Probe in der nassen Box, um feucht zu bleiben.

Hinweis: In diesem Schritt muss ProteinaseK gereinigt werden, sonst wird die anschließende Markierungsreaktion stark beeinträchtigt.

Schritt 2: Tunnelreaktion.

(5) Positive Behandlung (nur positive Kontrollen führen diesen Schritt durch, andere Proben führen den TUNEL-Reaktionsschritt direkt durch)

10 x DNase I-Puffer mit ddH2O im Verhältnis 1:10 zu 1 x DNase I-Puffer-Ersatz verdünnen.

b. 100 µL 1 x DNase I-Puffer auf die verarbeitete Probe tropfen und den gesamten Probenbereich abdecken, während Raumtemperatur 5 min ausgeglichen wird.

Verdünnen Sie die Arbeitsflüssigkeit mit 1 x DNase I-Puffer mit 1:100 DNase I (2 U/μL) bis zu einer Endkonzentration von 20 U/ml.

d. Entfernen Sie den Puffer, fügen Sie 100 μL DNaseI Arbeitsflüssigkeit in einer Konzentration von 20 U / ml und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min.

Entfernen Sie die DNase I-Arbeitsflüssigkeit und waschen Sie sie zweimal mit PBS.

Schritt 2: Tunnelreaktion.

2. Tunnelreaktion

(1) Herstellung von TUNEL-Reaktionsflüssigkeit

(2) Für Klebstoffzellen, Zellträge oder Gewebeschneiden

a. Zu jeder Probe werden 50 µL TUNEL-Reaktionsflüssigkeit hinzugefügt, damit die Reaktionsflüssigkeit die Probe gleichmäßig bedeckt. 37 ° C Lichtschutz geeignete Zeit für Inkubation (Zellen empfehlen Färbung Zeit 15-30 Minuten, Gewebe Färbung Zeit empfehlen 1h).

Hinweis: 50 μL Die TUNEL-Reaktionsflüssigkeit eignet sich für Schiebe, Schnitte oder 96-Loch-Platten (andere verschiedene Loch-Platten können das Volumen der TUNEL-Reaktionsflüssigkeit entsprechend anpassen und die Zellen abdecken). Wenn die zu untersuchende Probe ein Lack, ein Schnitt oder in einer 24-Loch-Platte, einer 12-Loch-Platte oder einer 6-Loch-Platte ist, können Sie eine verdampfende Folie verwenden, oder versuchen Sie selbst, einen Selbstverschließenden Beutel oder ein anderes geeignetes Material zu verwenden, um sich selbst in etwas kleinere runde Kunststoffplätze zu schneiden, die TUNEL-Reaktionsflüssigkeit zu tropfen, um die Probe zu bedecken, um zu verhindern, dass die TUNEL-Reaktionsflüssigkeit verdampft und die Probe gleichmäßig bedeckt.

b. Entfernen Sie die TUNEL-Reaktionslösung, waschen Sie sie zweimal mit PBS und verwenden Sie 0,1% Triton X-100 (PBS-Formulierung, die 5 mg / mLBSA enthält) reinigen 3 mal, je 5 min, so dass freie unreaktierte Marker sauberer entfernt werden können.

c. (optional) Zu jeder Probe eine angemessene Konzentration von 5 μg/ml DAPI-Infusion hinzufügenInkubieren5min。 Nachdem die Färbung abgeschlossen ist, entfernen Sie die DAPI-Färbung und waschen Sie die PBS zweimal für jeweils 5 Minuten.

d. (optional) Schneiddichtung: 20 μL Anti-Fluoreszenz-Auslöschtablette (Anti-Fluoreszenz) pro ProbeAuslöschtabletten können nicht für bestimmte Farbstoffe geeignet sein, vor dem Experiment wird eine Pre-Test-Match empfohlenGeschlecht), decken Sie die Abdeckfolie, schlagen Sie die Abdeckfolie sanft mit dem stummen Ende der Pinzette und entfernen Sie die Blasen, um die Abdeckfolie Wan zu machenAlle。

e. Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier absaugen und 100 µL in den Probenbereich einfügen PBS hält die Probe feucht,Sofort unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.

(3) Für suspendierte Zellen oder Zellsuspensionen

a. Zu jedem Probenröhrchen 50 µ LTUNEL Reaktionsflüssigkeit leicht Zellen resuspendieren, 37 ° C Lichtschutz inkubieren15-30min。 Suspendieren Sie die Zellen vorsichtig alle 10 min mit einer Spuren-Pipette.

b. 2000 U/min Zentrifuge 5min, Entfernung der TUNEL-Reaktion mit 0,1% Triton X-100(PBS-Zubereitung mit 5 mg/ml) BSA) Waschen Sie 2 Mal, jedes Mal 5min, so schwimmenNicht reagierende Marker können sauberer entfernt werden.

c. Zu jedem Probenröhrchen 100 μL DAPI-Infusion in einer Konzentration von 5 μg / ml hinzugefügt und bei Raumtemperatur 5 min mit Lichtschutz inkubiert.

400 μL hinzufügen PBS resuspendiert die Zellen, sofort nach der Erkennung mit einem Flow-Zytometer oder einer BeschichtungBeobachtung unter Fluoreszenzmikroskop.

Hinweise

1. Bitte zentrifizieren Sie das Produkt sofort auf den Rohrboden vor der Verwendung und führen Sie anschließende Experimente durch.

2. Färbung des Hintergrunds kann angemessen reduziert werden, wenn schwere oder unspezifische Färbung deutlich ist.

3. Es wird empfohlen, die negative und positive Kontrollgruppe zu erhöhen.

4. Wenn Komponente A verwendet wird, tragen Sie bitte eine Maske, Handschuhe, wie Kontakt mit der Haut, bitte sofort mit viel Wasser spülen.

5. Fluoreszenzfarbstoffe haben Löschprobleme, bitte achten Sie so gut wie möglich auf Lichtvermeidung, um das Löschen der Fluoreszenz zu verlangsamen.

Dieses Produkt ist ausschließlich für wissenschaftliche Forschung und darf nicht zur klinischen Diagnose oder Behandlung verwendet werden, nicht für Lebensmittel oder Medikamente verwendet werden und nicht in gewöhnlichen Wohnhäusern aufbewahrt werden.

7. Für Ihre Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte experimentelle Anzüge und Einweghandschuhe.