CHIP-Assay-Kit (Magnetisch)

Warennummer：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Lagerbedingungen：4°C aufbewahren

Produktbeschreibung

CHIP-Testkits werden verwendet, um Fällungen von Chromatinfragmenten, die an das Zielprotein gebunden sind, durch Immunosedimentation und schließlich Kits, um Fällungen von Chromatinfragmenten durch Methoden wie PCR oder Southern zu erkennen. Es wird häufig verwendet, um zu erkennen, ob genomische DNA-Bindeproteine wie bestimmte Transkriptionsfaktoren oder Histoproteine und die gewünschte spezifische genomische DNA-Sequenz im gleichen Komplex sind. Durch den ChIP-Test kann eine Schlussfolgerung erzielt werden, ob in vivo das Zielprotein und die erwartete DNA-Fragmente des Genoms im gleichen Komplex sind. Die Ergebnisse des ChIP-Tests zeigen, dass diese Bindung in der Zelle tatsächlich stattfindet.

BenDas CHIP-Testkit verwendet HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic-Perlen als CHIP-Abfallerperlen, die eine hohe Bindungskraft und zeitsparende und effiziente Eigenschaften besitzen. Die Kit liefert vorgemischte Kontrollprimere (Control Primers), die zur Verstärkung der teilweise entsprechenden Sequenz von humanem GAPDH verwendet werden können, mit der Sequenz: 5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Schritte (nur zur Information):

1. Optimierung der Probenbehandlungsbedingungen:

1. Vorbereiten Sie eine angemessene Menge von vorgekühltem PBS sowie 100mM PMSF. Der SDS-Lysepuffer wird in einem entsprechenden warmen Bad aufgelöst und vermischt.

2. Die Zellen werden in einer 250px Zellpetrieschale mit einer Dosierung von 10 ml Zellkultur kultiviert. Zu dem Zeitpunkt, an dem die Zielprotein- und Genomdna-Bindung erwartet wird, wird eine angemessene Menge Formaldehyd direkt in die Zellkultur hinzugefügt und leicht bis zu einer Endkonzentration von 1% vermischt. Inkubieren Sie dann für 10 Minuten bei 37 ° C, um das Ziel-Protein und die entsprechende genomische DNA zu kreuzen. Beispiel: Bei der Zugabe von 10 ml Zellkultur in 250px Zellpetrieschale müssen 270 µl 37% Formaldehyd hinzugefügt werden. Bitte beachten Sie, dass Sie möglichst hochwertige und effektive Formaldehyde während der Lebensdauer verwenden. Zellen können auch in einer 150 px Zellpetrieschale kultiviert werden, wobei die Dosierung der entsprechenden Lösung proportional angepasst werden muss.

1,1 ml Glycin Solution (10X) hinzufügen und vorsichtig vermischen. 5 Minuten auf Raumtemperatur lassen.

4. Setzen Sie eine Petrischale mit Zellproben auf ein Eisbad. Absaugen Sie eine Kulturflüssigkeit, die Formaldehyd und Glycin enthält, um möglichst keine Flüssigkeitsreste zu halten.

5. Platzieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten, während der 100 mM PMSF mit vorgekühltem PBS auf 1 mM verdünnt wird, d. h. PBS mit 1 mM PMSF, das zu einem Eisbad vorgekühlt wird. Die wasserbasierte PMSF-Lösung muss frisch hergestellt werden und hat eine Halbwertszeit von etwa 30 Minuten in der Wasserphase.

Fügen Sie 5-10 ml vorgekühltes PBS (mit 1 mM PMSF) hinzu, waschen Sie die Zellen, saugen Sie die Flüssigkeit aus und versuchen, keine Flüssigkeitsreste zu halten.

7. Fügen Sie 5-10 ml vorgekühltes PBS (mit 1 mM PMSF) hinzu, waschen Sie die Zellen weiter und saugen Sie die Flüssigkeit aus, um möglichst keine Flüssigkeitsreste zu halten.

8. Fügen Sie 1 ml vorgekühltes PBS (mit 1 mM PMSF) hinzu, schraben Sie die Zellen mit einem Zellschraber ab und sammeln Sie sie in eine Zentrifuge. Wenn Zellen mit einer Pistole geschlagen werden können, können sie auch mit einer Pistole geschlagen werden. Die Zellen werden gezählt und in etwa eine Million Zellen pro Rohr aufgeteilt.

4 ° C, 800-1000g Zentrifugieren für 1-2 Minuten, um die Zellen vollständig auszufallen. Wenn eine unzureichende Niederschlagung festgestellt wird, kann die Zentrifugalzeit angemessen verlängert werden. Absaugen, um Flüssigkeitsreste zu minimieren.

Zubereiten Sie einen SDS-Lysepuffer mit 1 mM PMSF in ausreichender Menge. Die 1 Million Zellen in den Schritten oben wurden mit 0,2 ml SDS Lyse Puffer mit 1 mM PMSF resuspendiert.

Inkubieren Sie 10 Minuten im Eisbad, um die Zellen vollständig zu spalten.

Ultraschallbehandlung, um die DNA des Genoms zu schneiden, so dass die DNA zum größten Teil in eine Größe von 200-1000 bps zerbrochen wird, ist besser, wenn die meisten Fragmente auf 400-800 bps kontrolliert werden können. Bitte beachten Sie während des Ultraschallprozesses, dass die Probe in einem Eisbad auf niedriger Temperatur gehalten wird. Die Auswirkungen des Ultraschallschneidens können nach der anschließenden Entkreuzung durch eine konventionelle DNA-Gelelektrophoresis nachgewiesen werden. Die Bedingungen für die Ultraschallbehandlung können in der Regel auf 10 Sekunden je eingestellt werden, insgesamt 3-4 Mal, bei einer Leistung von 50W auf 30% der maximalen Leistung eingestellt werden, wobei ein 2mm-Ultraschallkopf verwendet wird.

Die Einstellungen der verschiedenen Ultraschallbehandlungsinstrumente sind nicht sehr ähnlich, wenn Sie die Ultraschallbedingungen durchsuchen, können Sie zuerst andere Bedingungen fixieren, um zuerst festzustellen, wie lange jeder Ultraschall keine offensichtliche Hitze verursacht, und dann verschiedene Ultraschallzahlen durchsuchen. Bis die richtige Anzahl der Ultraschallfrequenzen gefunden wird, kann der Großteil des GenomsDie DNA wird in eine Größe von 200 bis 1000 bps gebrochen. Beachten Sie, dass das Ultraschallvolumen und die Zellverbrauchung jedes Mal festgelegt werden sollten, sonst können keine relativ festen Ultraschallbedingungen für die Folgeexperimente verwendet werden.

Anmerkungen: Genom nach dem UltraschallWenn die DNA-Größe getestet wird, wird die Gel-Punktfärbungsmethode verwendet (das heißt, Nukleinsäurefarbstoffe in den Ladepuffer hinzugefügt) oder die Gluefärbungsmethode verwendet, da sich die SDS bei der Elektrophorese mit solchen Farbstoffen verbindet, um abnorme Streifen zu bilden, die in der Regel etwa 500-1000 bp liegen, was eine gewisse Auswirkung auf die Beurteilung der DNA-Größe des Genoms nach dem Ultraschall hat. Es wird empfohlen, die Streifengröße nach der Färbung zu prüfen, wobei keine abnormen Streifen auftreten, die die Beurteilung der DNA-Größe des Genoms nach dem Ultraschall nicht beeinträchtigen und die Streifengröße genauer ist.

8 µl 5M NaCl in 0,2 ml ultraschallbehandelte Probe hinzufügen und vermischen. 65 ° C erhitzt für 4 Stunden, um die Vernetzung zwischen Protein und genomischer DNA zu entfernen.

14. Hinzufügen eines Tris-Gleichgewichts mit anderen VolumenBenzinfen，Vortex intensiv vermischt, gefolgt von 4ºC, 12.000 g ca. 5 Minuten zentrifugiert. Saugen Sie in ein anderes Zentrifugerrohr.

15. Hinzufügen eines anderen Volumens Chlorform, Vortex intensiv vermischt, anschließend 4ºC, 12000g ungefähr 5min zentrifugieren. Saugen Sie in ein anderes Zentrifugerrohr.

Anmerkungen：Die Phenolchloroform-Extraktion in den oben genannten Schritten 14 und 15 kann mit einem DNA-Reinigungskit betrieben werden.

16. Nehmen Sie eine kleine Menge an Flüssigkeit, die durch Phenolchloroform-Extraktion oder DNA-Reinigung-Kit erhalten wird, für Phenolchloroform-Extrakt-Produkte können 5-10ul, für DNA-Reinigung-Kit-Reinigungsprodukte können 2-5ul genommen werden, um die Gelelektrophoresis durchzuführen, beobachten Sie die Ultraschallbehandlung auf die Schnittwirkung der genomischen DNA.

2. Chromatin-Immunabfällung:

1. Nach der Optimierung der Ultraschallbehandlungsbedingungen für die ProbeOptimierung der Proben-UltraschallbehandlungsbedingungenMitte1-11Schritte für die Operation und Bezug auf die Schritte12 eine Ultraschallbehandlung durchführen.

2. Für Proben mit Ultraschallbehandlung bei 4ºC, 12000-14000g Zentrifuge 5min. Entnehmen Sie die Reinigung (ca. 0,2 ml) in einem 2 ml Zentrifugerrohr und legen Sie sie in ein Eisbad.

Herstellen Sie einen ChIP-Verdünnungspuffer mit 1 mM PMSF. Fügen Sie 1,8 ml ChIP-Verdünnungspuffer mit 1 mM PMSF hinzu, um die ultraschallbehandelte Probe zu verdünnen, so dass das Endvolumen 2 ml beträgt.

Entnehmen Sie die 20ul-Probe als Eingang für die Nachprüfung. Nehmen20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-MagnetperlenhinzufügenPBS- oder TBST-Lösung bis zu 500 µl für die Blasenreinigung, auf einem Magnetrestand mit einem Pipette vorsichtig abwaschen und 2-3 Mal wiederholen (für eine bessere Reduzierung der Unspezifizität 1 können auch 1-5% BSA oder Entfettete Milch Beads 1 Stunde vorbehandeln).

5. Reinigen oder verschließen20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-MagnetperlenSchritte hinzufügenDie übrigen 3 Proben können sowohl mit einer zelllosen Probe-Lösung als leere Kontrolle, sowie ohne Beads-Probe als negative Kontrolle oder mit unbedingten Antikörpern als negative Kontrolle verwendet werden. Drehen Sie langsam bei 4ºC oder schwingen Sie 30-60min zu mischen, um das Ziel-Protein oder den entsprechenden Komplex zu fällen.

6. Legen Sie das obige Zentrifugerrohr, das die Probe enthält, für 10 Sekunden auf den Magnetständer. Entfernen Sie sehr vorsichtig den Oberkörper und berühren Sie niemals die Niederlage. Anschließend wird die Abfällung mit der folgenden Lösung in einer Menge von 1 ml für jede Abfällung gewaschen, bei 4 ° C 3-5 Minuten langsam drehen oder schwanken und anschließend 10 Sekunden auf den Magnetständer gelegt. Entfernen Sie vorsichtig die obere Flüssigkeit und berühren Sie die Abfällung nicht.

(a) Einmal mit dem Low Salt Immune Complex Wash Buffer waschen.

(b) Einmal mit dem High Salt Immune Complex Wash Buffer waschen.

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer einmal waschen.

(d) TE Buffer zweimal waschen.

Anmerkungen：Die Abfälle, die nach Abschluss aller oben genannten Waschstufe erhalten werden, können für die Gensequenz zur PCR-Amplifikation oder für die Gensequenz zum Southern-Test oder für den Western-Test usw. verwendet werden.

Drei,PCR-amplifizierte Gensequenzen (z. B. ChIP-Produkte für den Nachweis von Gensequenzen):

1. Zubereiten Sie frisch eine angemessene Menge an Elutionspuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO3).

2. Abschluss der SchritteImmunisierungsschritte第7Schritt nach Schritt, d. h. nach Abschluss aller Wäscheschritte, fügen Sie250ul Elution buffer。 Vortex mischen, Raumtemperatur drehen oder schwanken Sie weiter 3-5min abwaschen.

3. 10 Sekunden lang auf dem Magnetständer abscheiden und die Oberfläche in ein neues Zentrifugerrohr übertragen. Zur Ausfällung werden 250 µl Elutionspuffer zugegeben. Vortex mischen, Raumtemperatur drehen oder schwanken Sie weiter 3-5min abwaschen.

4. Trennen Sie für 10 Sekunden auf dem Magnetständer und entfernen Sie die Oberfläche. Zusammenfügen Sie mit dem in Schritt 3 erworbenen HD. Insgesamt ca. 500ul.

5. 20 µl 5M NaCl in 500 µl Serum hinzufügen und vermischen. 65 ° C erhitzt für 4 Stunden, um die Vernetzung zwischen Protein und genomischer DNA zu entfernen. Für die 20 µl Probe, die als Eingang in Schritt 2D erhalten wurde, fügen Sie 1 µl 5M NaCl hinzu, mischen und 65 °C für 4 Stunden erhitzen, ebenfalls zur Entfernung der Vernetzung zwischen Protein und genomischer DNA. Nach Abschluss dieses Schrittes können die nächsten Schritte fortgesetzt werden, oder sie können zuerst bei -20ºC gefroren und am nächsten Tag fortgesetzt werden.

Anmerkungen1Diese Proben können bereits verwendet werdenPCR， Es kann versucht werden, 1, 2, 5 oder 10ul Proben als Vorlage für die PCR-Detektion von Genen zu verwenden. Die Wirkung der PCR ist zu diesem Zeitpunkt abhängig von der Menge an DNA, die abgefällt werden kann, und ob das gesamte PCR-Amplifikationssystem leicht das Zielgen ausbreitet. Wenn eine schlechte PCR-Wirkung festgestellt wird, können Sie die Reinigung und Konzentration der Probe durch nachfolgende Reinigungsschritte in Erwägung ziehen.

Anmerkungen2Normalerweise wird eine weitere Reinigung empfohlen.PCR-Detektion, Input erfordert in der Regel keine weiteren Reinigungsschritte.

6. Fügen Sie 10 µl 0,5 M EDTA, 20 µl 1M Tris pH 6,5 und 1 µl 20 mg/ml Protease K in etwa 520 µl Probe. Inkubieren Sie 60 Minuten bei 45°C nach Mischung.

7. Hinzufügen anderer Volumen Tris BalanceBenzinfen，Vortex intensiv vermischt, gefolgt von 4ºC, 12.000 g ca. 5 Minuten zentrifugiert. Saugen Sie in ein anderes Zentrifugerrohr.

8. Hinzufügen eines anderen Volumens Chlorform, Vortex intensiv vermischt, gefolgt von 4ºC, 12000g ungefähr 5 Minuten zentrifugieren. Saugen Sie in ein anderes Zentrifugerrohr.

Hinzufügen von 20 µg Glykogen oder Hefe tRNA, 1/10 des Volumens von 3M NaAc, pH 5,2 und 2,5-fach des Volumens wasserloses Ethanol. Nach dem Mischen fällt man bei -70ºC nicht weniger als 1 Stunde ab oder bei -20ºC fällt man mehr als 8 Stunden ab.

4 ° C, 12.000-14.000 g Zentrifuge für 10 Minuten, sorgfältig saugen Sie den größten Teil der oberen Klare und berühren Sie keine Niederlage.

11. Fügen Sie etwa 1 ml 70% Ethanol Waschfällung. 4ºC, 12000-14000g Zentrifuge 10min, sorgfältig saugen Sie den größten Teil der oberen Klare, niemals Berührung der Niederlage.

12. 4ºC, 12000-14000g Zentrifuge 1min, sorgfältig die Restflüssigkeit absaugen.

Die DNA wird mit einer kleinen Menge TE oder Wasser für den PCR-Test der Zielgene resuspendiert. Es ist am besten, zwei Gruppen von Prototypen für die PCR zu entwerfen, die entsprechenden PCR-Bedingungen mit Input als Vorlage im Voraus ausprobieren und eine Gruppe von effektiveren Prototypen für den endgültigen PCR-Test auswählen können. In seltenen Fällen, wenn die PCR-Streifen zu schwach sind, kann die verschachtelte PCR-Technik für eine zweirudige Amplifikation verwendet werden.

Anmerkungen: SchritteDie DNA kann in den Schritten 7 bis 13 auch mit einem geeigneten DNA-Reinigungskit gereinigt werden.

Vier,Western-Prüfung von ChIP-Produkten (wenn ChIP-Produkte für die Western-Prüfung verwendet werden):

1. Weitere SchritteChromatin-Immunfällung第8 Schritt, nach Abschluss aller Waschstufe, fügen Sie 25 µl SDS-PAGE Protein-ähnlichen Puffer (1X). Der SDS-PAGE-Protein-Superbuffer (1X) kann mit einer Wasserverdünnung des SDS-PAGE-Protein-Superbuffers (5X) hergestellt werden. Kochendes Bades 10 Minuten kochen.

Nehmen Sie 10-20ul für die westliche Prüfung.

Hinweis:

1. Eigen für ChIP-Widerstand, 37% Formaldehyd, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Protease K, Glykogen oder tRNA, Tris-GleichgewichtBenzinfenChlorform,95 % Ethanol, 70 % Ethanol, 3M NaAc (pH5,2) und Magnetreschalter, Zellrascher oder Zellschaufel.

2, benötigen Sie einen eigenen Ultraschallprobenprozessor (Sonicator), auch bekannt als Ultraschallzerkleinerer oder Ultraschallzellzerkleinerer.

3. Bearbeiten Sie bei der Verwendung von Formaldehyd bitte im Ventilationsschrank.

Dieses Produkt ist nur für die wissenschaftliche Forschung von Fachleuten eingeschränkt, darf nicht für die klinische Diagnose oder Behandlung verwendet werden, darf nicht für Lebensmittel oder Medikamente verwendet werden und darf nicht in gewöhnlichen Wohnhäusern gelagert werden.

Zur Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte eine experimentelle Anzug und Einweghandschuhe.