Zellfreie Protein-Expression-Kit - Dischwefelbindung-Verbesserte Version - Gefriertrocknetes Pulver

Warennummer：P0243L

Lagerbedingungen：-80℃，1Jahrwirksam

Trockeneis Transport. Nach dem Öffnen werden die zellfreien Proteinexpressionsreaktionskomponenten bei -80 ° C gelagert. Um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden, können die Flüssigkeit A und die Flüssigkeit B je nach der Aufteilung mit flüssigem Stickstoff gefriert und dann bei -80 ° C gelagert werden.

Produktkomponenten

Produktbeschreibung

Das Cell-Free Protein Synthesis KitEin Produkt zur in vitro Proteinsynthese auf Basis von E. coli-Zelllysaten. Dieses Produkt verwendetWirkstoffe wie Ribosome, Translationsfaktoren, Enzyme und andere in Zelllysaten, die gleichzeitig Energie ergänzen,Nukleotide, Aminosäuren, anorganische Salze usw. in vitro rekonstruiertÜbersetzungssystem. DNA oderRNA ist eine Vorlage, die Proteine ausdrückt. Zelllose Proteinexpression ist eine Art, die nicht von lebenden Bakterien abhängig ist,Schnelle und flexible Expression von Proteinen in großen Mengen im Vergleich zu herkömmlichen rekombinanten ExpressionssystemenMehr Vorteile:

1. Proteinexpression schnell, 1 ~ 2 h kann das Zielprotein ausdrücken, 8 ~ 24 h erreichen Sie die höchsteGroße Mengen.

2. Hohe Proteinexpression, maximaler Gao kann mehr als 3 mg / ml Protein erreichen.

3. Die Reaktion ist einfach und flexibel, es ist einfach, eine DNA- oder RNA-Vorlage in das Reaktionssystem hinzuzufügen.verwenden96-Loch-Platten oder Zentrifugerrohre reagieren.

Hinweis: Dieses Produkt kann herkömmliche Proteine ausdrücken und eignet sich besser für den Ausdruck von Proteinen mit Dischwefelbindungen.

Anwendungsbereich

Produkte Jin beschränken sich auf wissenschaftliche Forschungszwecke von Fachleuten und dürfen nicht für die klinische Diagnose oder Behandlung verwendet werden und dürfen nicht für Lebensmittel oder Medikamente verwendet werden.

Bedienungsanleitung

1. Genetische Konstruktion

Der Aufbau des Zielgens ist für die Proteinexpression von entscheidender Bedeutung und es wird empfohlen, die folgende Konstruktionsmethode zu verwenden. Das Ziel-Gen kann auf das positive Plasmid, das mit diesem Kit geliefert wird, aufgebaut werden (Plasmid-Diagramme finden Sie in der Datei im Scan-2D-Code auf der Außenpackung), d. h. wie folgt: Auch kompatibel mit PET-Plasmiden der Serie pET9a, pET-23a usw., die den T7-Starter enthalten, aber keinen Laktosemanipulator (lac) enthalten.

Hinweis: Plasmiden, die Lactosemanipulatoren enthalten (z. B. pET28a usw.) können einen größeren Einfluss auf die Erträge haben und werden nicht empfohlen, direkt zu verwenden.

Die DNA-Sequenz eines positiven Plasmids ist wie folgt dargestellt：

2. Vorlage vorbereiten

Zellfreie Proteinsynthese Kits können DNA oder mRNA als Vorlage zum Ausdruck von recombinanten Proteinen verwenden. Die verwendeten DNA-Vorlagen können Plasmide sein, PCR-Produkte oder Produkte mit phi29 für RCA-Rolling-Ring-Amplifikation.

2.1 Plasma: Erhalt von Plasmiden, die für zellfreie Reaktionen geeignet sind, durch Gene-Company-Synthese oder Subklone und die Extraktion von Plasmiden durch Säulenreinigung;

2.2 PCR-Produkte: Entwurf der Vorläufer, der positive Vorläufer ist ca. 200 bps vor dem T7-Starter, der inverse Vorläufer ist ca. 200 bps unterhalb des Endcodons (einschließlich des T7-Terminators), die Schablone wird vergrößert, und die erhaltenen linearen DNA-Fragmente können ohne Reinigung direkt in das zelllose Reaktionssystem eingesetzt werden. Die Funktion der 200 bp-Basis upstream und downstream ist es, lineare DNA-Fragmente vor endogenen Extochetasen zu schützen.

2.3 RCA-Produkte: Mit phi29-Polymerase, random Hexaprimers für Roll-Ring-Amplifikation RCA, die erhaltenen DNA-Produkte können direkt in zelllosen Reaktionssystemen verwendet werden.

2.4 PCR und RCA können mit Golden Gate und Gibson Assembly kombiniert werden, was die Geschwindigkeit und den Durchfluss der Vorbereitung von DNA-Schablonen erheblich verbessern wird.

2.5Die DNA-Vorlage muss vor der Verwendung genau bestimmt werden. Es wird empfohlen, hochwertige Plasmideextraktionskits für die Plasmideextraktion zu verwenden, um die Einführung von RNase A zu vermeiden; Die Plasmiden, die von Gensynthese-Unternehmen zurückgegeben werden, müssen die Säulenreinigung betonen, sonst können sie nicht direkt für zelllose Reaktionen verwendet werden.

3. Keine Zellproteinexpression

3.1Berechnen Sie die erforderlichen A- und B-Flüssigkeiten (Volumenverhältnis 1: 2), basierend auf der Gesamtmenge des Reaktionssystems, fügen Sie das verwendete Reagenz auf Eis in einen Reaktionsbehälter (z. B. eine 2 ml Rundbodenzentrifuge) und mischen. Der gesamte Betrieb erfordert Handschuhe, Masken und einen Pipettensaugekopf mit enzymfreier Quelle sowie Reaktionsbehältnisse, um die Einführung von Nukleatasen zu vermeiden.

Das zelllose Reaktionssystem kann nach der folgenden Tabelle gemischt werden:

3.2Fügen Sie die DNA-Schablone in das Reaktionssystem hinzu, die empfohlene Endkonzentration der DNA-Schablone beträgt 5 bis 10 μg/ml, um die Menge der DNA-Schablone zu optimieren.

3.3Legen Sie den Reaktionsbehälter in ein normales Schüttelbett oder ein Thermostat-Mischer für eine zellfreie Proteinexpression, die empfohlene Reaktionstemperatur beträgt 25 ~ 30 ° C. Eine Senkung der Temperatur verringert die Geschwindigkeit der Proteinsynthese, erhöht aber die Löslichkeit des Proteins. Die Reaktion erreicht die maximale da-Protein-Ausbeute in etwa 8 h und kann über Nacht 16 h reagieren. Wenn die Reaktionstemperatur sinkt, sollte die Reaktionszeit angemessen erhöht werden.

3.4Die zellfreie Proteinexpression erfordert ausreichend Sauerstoff und das Reaktionssystem übersteigt nicht 100 μl, wenn eine 2 ml Rundbodenzentrifuge als Reaktionsbehälter verwendet wird. Eine zellfreie Proteinreaktion kann in gleichem Verhältnis vergrößert werden, und ein vergrößertes Reaktionssystem erfordert die Verwendung größerer Reaktionsbehälter, wie zum Beispiel Schüttelflaschen, während die Drehzahl des Schüttelbettes (200 U/min) gewährleistet ist.

4. Prüfung

Am Ende der Reaktion nehmen Sie etwa 1 μl Reaktionsflüssigkeit (Detektion des gesamten Proteins) oder Reaktionserum (Detektion des löslichen Proteins) und führen Sie die SDS-PAGE-Proteingel-Elektrophoresis zur Detektion der Proteinexpression durch.

5. Positive Kontrolle

Dieses Kit enthält das grüne Fluoreszenzprotein sf-GFP-Plasmid als positive Kontrolle, die die Reaktionsergebnisse direkt mit dem bloßen Auge beobachten kann. Nach erfolgreicher Expression von sf-GFP wird das zellfreie Reaktionssystem offensichtlich grün sein.

Für die genaue Quantifizierung von sf-GFP kann ein Enzym-Calibrator verwendet werden (Ex/Em = 485/528 nm).