TRzol LS (flüssiges RNA-Extraktionsreagens für Proben)

Eigenschaften:

Lagerbedingungen:

TRzol LS ist 12 Monate lang bei Raumtemperatur stabil zu halten. Für optimale Ergebnisse empfehlen wir jedoch die Lagerung bei 2-8°C.

Wichtige Hinweise:

Giftstoffe, die die Haut berühren oder versehentlich verschlucken, können zu Verbrennungen führen. Nach dem Kontakt mit der Haut mit viel Waschmittel und Wasser reinigen. Wenn Sie sich unwohl fühlen, wenden Sie sich an Ihren Arzt und suchen Sie nach der richtigen Behandlung mit anderen Inhaltsstoffen.

Produktbeschreibung:

TRzol LS ist ein Reagenz, das die GesamtRNA direkt aus Zellen oder Geweben extrahiert. Es behält die Integrität der RNA beim Zerbrechen und Auflösen von Zellen. Nach Zugabe von Chlorform wird die Probe in eine Wasserschicht, eine Zwischenschicht und eine organische Schicht aufgeteilt. RNA befindet sich im Wasser. Nach der Sammlung der oben genannten Wasserprobenschicht kann die RNA durch Isopropanolabsetzung wiedergewonnen werden. Ob es sich um Menschen, Tiere, Pflanzen oder Bakterien handelt, diese Methode hat eine bessere Trennung von kleinen und großen Mengen an Gewebe und Zellen. Die einfache Bedienung des TRzol LS-Reagents erlaubt

Bearbeitung mehrerer Proben. Alle Operationen können innerhalb einer Stunde durchgeführt werden. Die von TRzol extrahierte GesamtRNA verhindert die Verunreinigung von DNA und Proteinen und kann für die RNA-Abdruckanalyse, Spot-Hybridisierung, Poly(A)+-Screening, in vitro-Translation, RNA-Enzymschutzanalyse und molekulares Klonen verwendet werden. Wenn es sich um PCR handelt, wird empfohlen, die extrahierte GesamtRNA mit einer amplifizierten DNase I zu verarbeiten, wenn sich zwei Prototypen innerhalb eines einzigen Exons befinden.

Hinweis:

1. Isolieren Sie eine RNA-Probe aus einer kleinen Menge an Gewebe (1-10 mg) oder Zellen (10 2-10 4 Stück): 800 µl TRzol in Gewebe oder Zellen hinzufügen. Nachdem die Probe geklatzt ist, wird Chlorform hinzugefügt und die Extraktion in Schritt 2 durchgeführt. Vor der Fällung von RNA mit Isopropanol werden 5 bis 10 μg RNA-freies Glykogen als Träger für die Hydroprobenschicht hinzugefügt. Um die Viskosität zu reduzieren, pumpen Sie die Spritze 26 zweimal vor der Zugabe von Chloroform, um die DNA des Genoms zu schneiden. Glykogen bleibt in der Probe und wird mit der RNA analysiert. Bis zur Konzentration auf 4 mg/ml hemmt es weder die Synthese der ersten Kette der Retroreskriptionsreaktion noch die PCR.

Nach Homogenisierung und vor der Zugabe von Chloroform kann die Probe mindestens einen Monat bei -60 ° C oder -70 ° C gelagert werden. Die RNA-Fällung in 75% Ethanol kann mindestens eine Woche bei 2-8 ° C und mindestens ein Jahr bei -5-20 ° C aufbewahrt werden.

3. Wenn Sie mit TRzol LS RNA extrahieren, tragen Sie Handschuhe und Augenschutz. Vermeiden Sie Kontakt mit Haut und Kleidung. Der Betrieb wird in einem chemischen Ventilationsschrank abgeschlossen. Vermeiden Sie Atemwege. Ohne Ausnahme bleibt die Raumtemperatur bei 15 bis 30 ° C.

Eigenes Reagenz:

Chlorform, Isopropanol, 75% Ethanol (RNase-freies Wasser), RNase-freies Wasser (Wasser in eine Glasflasche ohne RNA-Enzyme, DEPC bis 0,1% (V/V) hinzufügen). Übernachten und unter hohem Druck sterilisieren). 0,5% SDS-Lösung (RNase-freies Wasser) (optional).

Betriebsschritte:

1. Probenvorbehandlung a. Biologische Flüssigkeiten 0,75 ml TRzol LS für jede 0,25 ml flüssige Probe (Serum, Plasma usw.) hinzufügen und die flüssige Probe mehrmals mit einer Probengewehr schlagen, um die Zellen in der Probe zu spalten. Mindestens 0,75 ml TRzol LS pro 5 bis 10 x 10 6 Zellen hinzugefügt. Für Proben mit hohem Schadstoffgehalt wie Vollblutproben kann die Extraktion mit Sterilisierungswasser im Verhältnis 1: 1 verdoppelt werden. Das Endvolumenverhältnis von TRzol LS und Flüssigkeitsproben ist immer 3:1. Gewebeproben mit Glas oder einem starken Homogenator rühren und 0,75 ml TRzol LS pro 50 bis 100 mg Gewebe oder 0,25 ml Gewebesuspension hinzufügen. In der Regel ist das Gewebevolumen von 50 bis 100 mg kleiner als 0,25 ml, wenn das Volumen der Gewebeprobe kleiner ist als 0,25 ml, fügen Sie Sterilisierungswasser hinzu, um das Gewebeprobenvolumen auf 0,25 ml anzupassen, um sicherzustellen, dass das Volumenverhältnis 3: 1 ist. c. Einschichtig wachsende Zellen 0,3 ml-0,4 ml von TRzol LS gelösten Zellen direkt in eine Platte mit einem Durchmesser von 3,5 cm hinzufügen und mit einer Probengewehr schlagen, um die Zellen vollständig zu spalten. Bestimmen Sie die gewünschte Menge an TRzol LS (pro 10cm2 plus 0,3-0,4 ml) anhand der Fläche der Platte und nicht anhand der Anzahl der Zellen. Es ist nicht notwendig, Wasser in das Klysat hinzuzufügen, da die restliche Kulturflüssigkeit, die an der Platte befestigt ist, TRzol LS ausreichend verdünnt hat. d. Suspendierte Wachstumszellen Die Zellen sedimentieren durch Zentrifuge. Die Zellen werden wiederholt mit einer Pipette im TRzol LS-Reagenz aufgespalten. Zu 5 bis 10 x 10 6 Tierzellen, Pflanzen oder Hefe Zellen oder 1 x 10 7 Bakterien mit 0,75 ml TRzol LS. Regeln Sie das Probenvolumen auf 0,25 ml mit Sterilwasser wie in Schritt b. Vermeiden Sie das Waschen der Zellen vor der Zugabe von TRzol LS, da dies die Wahrscheinlichkeit des mRNA-Abbaus erhöht. Das Brechen bestimmter Hefen und Bakterien kann den Einsatz eines Homogenizers erfordern. 2. Isolationsphase Homologenproben werden 5 min bei 15-30 ° C inkubiert, um das Nukleosom abzubauen. Zu jedem 0,75 ml TRzol LS werden 0,2 ml Chloroform hinzugefügt. Abdecken Sie den Probenrohrendeckel, schütteln Sie den Probenrohr mit der Hand für 15 Sekunden und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 2 bis 15 Minuten. Gefrierzentrifugieren bei 2 bis 8 °C mit einer hohen Geschwindigkeit von nicht mehr als 12.000 x g Zentrifuge für 15 min. Die Mischung nach der Zentrifuge ist in drei Schichten unterteilt: die untere Schicht - Chloroformschicht, die mittlere Schicht und die obere Schicht der farblosen Wasserprobe. RNA findet sich ohne Ausnahme in der Wasserschicht. Die Kapazität der Wasserprobenschicht beträgt etwa 70% der zugesetzten TRzol LS-Kapazität.

2. RNA-Fällung Übertragen Sie die Hydroprobenschicht in ein sauberes Röhrchen, wenn Sie DNA und Proteine isolieren möchten, müssen die organischen Schichten und die Zwischenschichten ebenfalls erhalten werden. Die RNA wird durch Mischen von Wasserprobenschichten und Isopropanol ausgefällt. Jede 0,75 ml TRzol LS entspricht 0,5 ml Isopropanol. Die gemischte Probe wird 10 min bei 15-30 ° C inkubiert und 10 min bei 2-8 ° C mit einer hohen Geschwindigkeit von nicht mehr als 12.000 x g Zentrifuge gefriert. Die RNA-Fällung ist vor der Zentrifugation in der Regel nicht sichtbar und bildet nach der Zentrifugation eine gelförmige Fläche. Die Fällung befestigt sich an der Probenwand und dem Rohrboden.

3. RNA Spülen Entfernen Sie die obere Suspension. Die RNA-Fällung wird einmal mit 75% Ethanol (RNase-freies Wasser) gewaschen und mindestens 1 ml 75% Ethanol pro 0,75 ml TRzol LS zugesetzt. Die Probe wird mit Wirbelschwingung vermischt und bei 2 bis 8 °C bei einer hohen Geschwindigkeit von nicht mehr als 7.500 x g gefriert.

4. RNA-Wiederlösung Einfach trocknen Sie die RNA-Fällung bei Raumtemperatur und trocknen Sie die RNA nicht in einem Vakuumrohr. Besonders wichtig ist, dass die RNA-Fällung nicht trocknen lässt, was ihre Löslichkeit erheblich verringert. Teilweise gelöste RNA-Proben hatten ein OD260/OD280-Verhältnis < 1,6. RNase-freies Wasser oder eine 0,5%-ige SDS-Lösung (RNase-freies Wasser-Formulierung) werden mehrmals mit einer Pipette aufgeteilt, um die RNA zu lösen (Vermeiden Sie die Verwendung von SDS, wenn die RNA später für eine enzymatische Schnittreaktion verwendet werden soll). RNA kann auch mit 100% Formamid (Ionen entfernt) wieder gelöst und bei -70 ° C aufbewahrt werden.

PCR-Schritte und Vorsichtspunkte?

I. Experimentelle Prinzipien

PCR ist eine Methode zur künstlich selektiven Amplifikation von DNA in vitro, die der Replikation von DNA in einem Organismus ähnelt. Die DNA-Replikation im Organismus erfordert Vorlagen, Prototypen, DNA-Polymerasen, DNA-Helylasen, dNTPs; In vitro PCR-Reaktionen erfordern ähnliche Komponenten, wie Schablonen, Prototypen, PCR-Puffer, Taq-Enzyme, dNTPs。 wobei die Vorläufer eine bestimmte Sequenz sind, die von Hand entworfen wurde, um eine Verstärkung an einer bestimmten Stelle zu erreichen; PCR-Puffer bietet eine Pufferumgebung für Reaktionen; Der Reaktionsprozess, wie in einem Organismus, öffnet sich die Doppelkette der DNA, der Vorläufer bindet sich an die Schablone und verlängert sich zu einer neuen Kette. Diese Prozesse werden im Organismus durch DNA-Helylase-Entkettung und außerhalb des Organismus durch die Kontrolle der Reaktionstemperatur erreicht. Wie üblich, öffnen Sie die Doppelkette mit 94 ° C Degenerationsschablone-DNA, binden Sie die Vorläufer an die Schablone bei der Hitztemperatur, schließlich verlängern Sie sie bei 72 ° C und wiederholen Sie diesen Prozess, um eine erhebliche Vergrößerung eines bestimmten DNA-Fragments zu erreichen. Erst am Beginn des dritten Zyklus werden die gleichen DNA-Moleküle wie die ZielDNA-Segmente erzeugt, was den Index der ZielDNA-Segmente weiter zyklisch verdoppelt.

In der späteren Phase der Vergrößerung wird die ursprüngliche exponentiell vergrößerte Reaktion aufgrund der Produktakumulation in eine flache Kurve verwandelt, und das Produkt steigt nicht mehr deutlich mit der Anzahl der Zyklen, was als Plattformeffekt bezeichnet wird. Die Plateau-Phase führt dazu, dass die niedrigen Konzentrationen von nicht spezifischen Produkten, die ursprünglich durch Fehlversammlungen entstanden waren, weiter erheblich zunehmen und höhere Niveaus erreichen. Daher sollte die Anzahl der Zyklen angemessen angepasst werden, um die Reaktion vor der Plattformperiode zu beenden und das nicht spezifische Produkt zu reduzieren. Die Anzahl der Zyklen, die benötigt werden, um das Plateau zu erreichen, hängt von der Kopie der Vorlage in der Probe ab.

II. Hauptbestandteile

Vorlagen können in verschiedenen Formen sein, hauptsächlich genomische DNA, Plasmid-DNA, genomische DNA, die Viren tragen, PCR-Produkte, cDNA usw., aber nicht RNA. Bei verschiedenen Typen von Vorlagen liegt der Hauptunterschied in der Zeit der Vorherstellung und der Menge der Vorlagen. In der Regel für große Genom-DNA-Prädaktionszeit 10 min ausreichend, Plasmid-DNA2min, Genom-DNA-Prädaktionszeit von 2 min, PCR-Produkt-Prädaktionszeit von 2 min.

Beachten Sie, dass cDNA eine einkettige DNA ist, aber es ist immer noch möglich, eine PCR-Vorlage zu machen, mit der Ausnahme, dass nur ein Prototyp während des ersten Zyklus bindet und eine andere Kette synthetisiert. Ab der zweiten Runde binden beide Primäre an spezifische Stellen, wodurch eine Anbindung an herkömmliche PCR erreicht wurde. Die gleiche RNA als Einzelkette kann jedoch nicht durch PCR-Amplifikation durchgeführt werden, da die PCR-Reaktion durch die DNA-Polymerase erreicht wird, die nur absichtlich die DNA-Kette identifiziert.

2. Für die Menge der Schablone beträgt die Masse der allgemeinen 25ul-System-DNA 50,100 ng. Für Genom-DNA ist die Konzentration der Extraktion aufgrund ihrer komplexeren Struktur oft größer. Um zu verhindern, dass eine zu hohe Konzentration die PCR beeinflusst, muss die extrahierte DNA gradient verdünnt werden. Ansonsten kann eine zu hohe Konzentration zu einer unspezifischen Verstärkung führen. Für Plasmide und PCR-Produkte ist aufgrund ihrer einfachen Struktur und der in der Regel niedrigeren Extraktionskonzentration keine Verdünnung erforderlich.

Welche Probleme sollte man beim PCR-Test beachten?

Kein CT-Wert

Die Testergebnisse haben keine Ct-Werte, um die folgenden Probleme zu beheben:

1, die Anzahl der Zyklen ist nicht ausreichend (in der Regel nicht mehr als 45 Zyklen, nicht nur der Hintergrundwert verbessert, sondern auch quantitativ nicht erlaubt);

2, das PCR-Verfahren ist falsch eingerichtet, die Schritte zur Erkennung des Fluoreszenzsignals sind falsch. Die allgemeine SG-Methode nimmt die Erfassung bei 72 ° C-Verlängerung an, TaqMan-Gesetz erfasst in der Regel das Signal am Ende der Ausbrennung oder bei der Verlängerung, und ob die Fluoreszenzaufnahme ausgewählt ist;

3. Abbau von Vorläufern oder Sonden. Über die PAGE-Elektrophoresis kann nachgewiesen werden, ob sich Vorläufer und Sonden abbauen;

Die Schablonenmenge kann sich abbauen oder die Probenmenge ist unzureichend (nicht mehr als 500ng, entsprechend der Kit-Anleitung), die Probe mit unbekannten Konzentrationen sollte mit der höchsten Konzentration der Serienverdünnungsprobe beginnen; Wenn die Schablone Abbau auftritt, sollte die Einführung von Verunreinigungen in der Probenvorbereitung und die Situation der wiederholten Gefrierschmelzung berücksichtigt werden, und es wird empfohlen, die Schablonenprobe in kleinen Mengen aufzuteilen, um wiederholte Gefrierschmelzung zu vermeiden;

5. ob die Primärsonde geeignet ist (insbesondere wenn die Primärsonde den Endokontenten überschreitet, um die Amplifikation der genomischen DNA zu gewährleisten); Ein Wert von Tm über 4 ° C kann auch die Vergrößerung beeinflussen).

CT zu spät

In der relativen Quantifizierung ist der Ct-Wert in der Regel besser zwischen 1525 kontrolliert, wenn in der absoluten Quantifizierung der Ct-Wert für eine Probe mit einer geringen Kopienzahl erhöht wird, sollte jedoch in der Regel nicht mehr als 40 Zyklen sein, sonst ist die Quantifizierung ungenau.

Daher muss festgestellt werden, ob ein zu spät auftretender Ct-Wert eine ungewöhnliche Situation ist, basierend auf dem spezifischen Design und dem Zweck des Experiments.

1. Niedrige Effizienz. Das Verhältnis zwischen den Vorläufern oder zwischen den Vorläufern und der Sonde ist nicht angemessen und muss optimiert werden; Die Vorlage oder die Sonde ist nicht vernünftig und muss neu gestaltet werden;

2, das PCR-Verfahren ist nicht geeignet, anstelle der Drei-Schritte-Methode zur Reaktion oder zur Optimierung der Ausbrenntemperatur / Verlängerungstemperatur, kann die Ausbrenntemperatur angemessen reduziert werden; Kurze Ausbrenn- / Verlängerungszeit (kann unter den empfohlenen Zeitbedingungen zu 10s verlängert werden);

3, MgCl2-Konzentration ist nicht geeignet, erhöht die Magnesium-Ionen-Konzentration usw. unzureichende Abbau oder Probenmenge der verschiedenen Reaktionskomponenten der PCR;

Das PCR-Produkt ist zu lang. PCR-Produkt-Design über 500bp;

5. Inhibitoren in der Vorlage vorhanden. Durchführen Sie einen PCR-Test mit einer hochreinen Schablone oder verdünnen Sie die Schablone.

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