Acetonsäuredehydrogenase (PDH) Aktivitätsprüfkit Spurmethode

Acetonsäuredehydrogenase (PDHAktivitätsprüfkit Anleitung Spurmethode

Hinweis: Das Reagenz dieses Produkts hat sich geändert, beachten Sie bitte und befolgen Sie strikt die Anleitung.

Warennummer:BC0385

Spezifikationen:100T/96S

Produktzusammensetzung: Bitte überprüfen Sie vor der Verwendung sorgfältig, ob das Volumen des Reagents mit dem Volumen in der Flasche übereinstimmt. Bei Fragen wenden Sie sich bitte unverzüglich an das Personal von Solebar.

Acetonsäuredehydrogenase (PDH) Aktivitätsprüfkit Spurmethode

Acetonsäuredehydrogenase (PDH) Aktivitätsprüfkit Spurmethode

Zubereitung der Lösung:

1. Reagenz 2：Für flüchtige Reagenzien, so schnell wie möglich nach dem Gebrauch versiegeln,-20℃Speichern.

2. Zubereitung der Arbeitsflüssigkeit: Vor der Anwendung5,75 mlReagenz 4, ein Reagenz 5,0,45 mlReagenz 6,1,75 mlReagenz sieben übertragen in eine Flasche Reagenz drei gemischt, um zu lösen(insgesamt)15.45mLEtwa.85T）Unendliche Reagenzien-20℃Aufteilung, aufbewahrbar4Woche.Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren.

Produktbeschreibung:

PDH（EC 4.1.1.1Weit verbreitet in Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen und Kulturzellen, ist Acetonat-Dehydrogenase-Komplex(PDHC)Katalysiert das Geschwindigkeitsbegrenzungsenzym für Acetonsäure-Decarboxylation, katalysiert Acetonsäure-DecarboxylationGlykolyse und den Tricarbonsäurezyklus verbinden.

PDHKatalysiert Acetonsäure Entwasserstoff während der Reduktion2,6-Indigo-Dichlorphenol (2,6-DCPIP), was dazu führt605 nmVerringerung der Lichtabsorption.

Pyruvinsäure + Thiamin Pyrophosphat Hydroxyethylthiamin Pyrophosphat

Dichlorphenolindophenol (605nm) + Hydroxyethylthiamin Pyrophosphat Reduziertes Dichlorphenolindophenol

Hinweis: Auswahl vor dem Experiment empfohlen2-3Eine Probe mit hohen erwarteten Unterschieden wird vor dem Experiment durchgeführt. Wenn der Absorptionswert der Probe nicht im Messbereich liegt, wird eine Verdünnung oder Erhöhung der Probenmenge empfohlen.

Eigene Geräte und Zubehör:

Sichtbares Spektrophotometer/Enzym-Calibrator, Wasserwanne, Tischzentrifuge, verstellbare Pipette, Spurgelassvergleichsschale/96Bohrplatten, Platten/Absorber, Eis und destilliertes Wasser.

Betriebsschritte:

Einer,Probenbehandlung(Die Probenmenge kann angemessen angepasst werden, die spezifischen Verhältnisse können in der Literatur verwiesen werden)

1. Organisation: ungefähr0.1gOrganisation, Beitritt1 mlReagenz 1 und10μLReagenz 2, voll mit einem Eisbad-Homogenizer oder einem Grill-Homogenizer geschliffen,4 ℃ 11000gZentrifugieren10 MinutenEntfernen,Bleib auf dem Eis.Testen.

2. Zellen- oder Bakterienproben: Zuerst sammeln500Millionen Zellen oder Bakterien in das Zentrifugerrohr, nach der Zentrifuge entsorgt; Anschließend beitreten1mLReagenz 1 und10μLReagenz 2, Eisbad Ultraschall zerbrechen Bakterien (Leistung200 WUltraschall.3 sIntervall.7 sGesamtzeit5 Minuten）； dann11000g，4℃, Zentrifugierung10 Minuten，

Entfernen und auf dem Eis testen.

3. Serum (Pulse)und andere FlüssigkeitsprobenDirekte Prüfung.Wenn die Lösung trüb ist, wird die Messung nach der Zentrifuge durchgeführt.

II. Bestimmungsschritte

1、sichtbarSpektrophotometer oder Enzym-Calibrator Vorwärmung30 MinutenStellen Sie die Wellenlänge auf605 nmSpektrophotometer destilliert Wasser auf Null.

2、Jede Probe benötigt180 μLArbeitsflüssigkeit,Nach dem Experiment erforderlichEntfernen Sie eine gewisse Menge Arbeitsflüssigkeit in37℃(Säugetiere) oder25℃(andere Arten)Badewanne im WasserWasserbad10 Minuten。

3、Leere Rohre: in Spuren von Ceramic Schalen oder96Hinzufügen in die Bohrplatte180 μLArbeitsflüssigkeit und10μLWasser, mischen, sofort aufzeichnen605 nmStelle10sStelleAbsorptionswertA1und1min10sAnschließende AbsorptionswerteA2Berechnen.ΔALeer= A1 bis A2。Leere Rohre müssen nur gemessen werden1-2Mal。

4、Messrohr: in Spuren-Benchmark-Scheiben oder96Hinzufügen in die Bohrplatte180 μLArbeitsflüssigkeit und10μLProbe, Mischen, sofort aufzeichnen605 nmStelle10sStelleAbsorptionswertA3und1min10sAnschließende AbsorptionswerteA4Berechnen.ΔAMessung= A3-A4。

Drei,PDHAktive Berechnung

a.Die Berechnungsformel, die mit einer Spurenvergleichsschale gemessen wurde, ist wie folgt:

1. Berechnung nach Proteinkonzentration

Definition der Einheit: JedermgTistoproteine werden pro Minute im Reaktionssystem verbraucht1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/mg Prot）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)÷（ε × d）× VGegen General×10⁹]÷(Cpr×Vwie÷T

= 904,762×(ΔA)Messung-ΔALeer÷Cpr

2. Berechnung nach Probenqualität

Definition der Einheit: JedergGewebe verbraucht jede Minute im Reaktionssystem1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/gQualität)=[(ΔA)Messung-ΔALeer)÷（ε × d）× VGegen General×10⁹]÷(V)wie÷VGesamt× W) ÷T

= 913,81×(ΔA)Messung-ΔALeer÷W

3. Berechnen nach der Anzahl der Bakterien oder Zellen

Definition der Einheit: Jeder1Tausende Bakterien oder Zellen werden pro Minute im Reaktionssystem verbraucht1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/10⁴Zelle）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷（ε × d）×10⁹]÷(V)wie÷VGesamt× 500)÷T

= 1,828×(ΔA)Messung-ΔALeer)

4. Berechnen nach Probenvolumen

Definition der Einheit: JedermLFlüssigkeitIm ReaktionssystemVerbrauch pro Minute1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivität（U/ml）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷(ε×d)×10⁹]÷Vwie÷T

= 904,762×(ΔA)Messung-ΔALeer)

VAnti-Total: Gesamtvolumen des Reaktionssystems,1.9×10^-4L；ε：2,6-Der molare Dämpfungskoeffizient von Dichlorphenol,2.1×10⁴L/mol/cm；d: Lichtdurchmesser,1 cm；VProbe: Fügen Sie das Probenvolumen hinzu,0,01 ml；VProbensumme: Reagenz I und Reagenz II Volumen hinzufügen,1,01 ml；TReaktionszeit,1min；CprProteinkonzentration der Probe,mg/ml；WProbenqualität,g；500Anzahl der Bakterien oder Zellen,500Tausende.

b.verwenden96Die Berechnungsformel für die Bohrplattenmessung lautet wie folgt:

1．Berechnung nach Proteinkonzentration

Definition der Einheit: JedermgTistoproteine werden pro Minute im Reaktionssystem verbraucht1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/mg Prot）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷（ε × d）×10⁹]÷(Cpr×Vwie÷T

= 1809,524×(ΔA)Messung-ΔALeer÷Cpr

2．Berechnung nach Probenqualität

Definition der Einheit: JedergGewebe verbraucht jede Minute im Reaktionssystem1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/gQualität)=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷（ε × d）×10⁹]÷(V)wie÷VGesamt× W) ÷T

= 1827,62×(ΔA)Messung-ΔALeer÷W

3．Berechnen nach der Anzahl der Bakterien oder Zellen

Definition der Einheit: Jeder1Tausende Bakterien oder Zellen werden pro Minute im Reaktionssystem verbraucht1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivitäten (U/10⁴Zelle）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷（ε × d）×10⁹]÷(V)wie÷VGesamt× 500) ÷T

= 3,655×(ΔA)Messung-ΔALeer)

4．Berechnen nach Probenvolumen

Definition der Einheit: JedermLFlüssigkeitIm ReaktionssystemVerbrauch pro Minute1nmol 2,6-Indigo ist als Enzymaktivitätseinheit definiert.

PDHAktivität（U/ml）=[(ΔA)Messung-ΔALeer)×VGegen General÷(ε×d)×10⁹]÷Vwie÷T

= 1809,524×(ΔA)Messung-ΔALeer)

VAnti-Total: Gesamtvolumen des Reaktionssystems,1.9×10^-4L；ε：2,6-Der molare Dämpfungskoeffizient von Dichlorphenol,2.1×10⁴L/mol/cm；d：96Lichtdurchmesser,0,5 cm；VProbe: Fügen Sie das Probenvolumen hinzu,0,01 ml；VProbensumme: Reagenz I und Reagenz II Volumen hinzufügen,1,01 ml；TReaktionszeit,1min；CprProteinkonzentration der Probe,mg/ml；WProbenqualität,g；500Anzahl der Bakterien oder Zellen,500Tausende.

Hinweis:

1、Alle Proben werden während der Messung auf Eis platziert.2Innerhalb einer Stunde zu erkennen, um Veränderungen und Inaktivierungen zu vermeiden.

2、MessrohreΔAWert in0.01-0.25Zwischen, wenn die MessungΔAWert größer als0.25Die Probe muss verdünnt werden.Berechnen Sie das Verdünnungsvermöglichte in der Formel.Wenn das Rohr bestimmt wirdΔAWertekleinauf0.01Die Probengröße muss nach der Erhöhung neu bestimmt werden, beachten Sie die synchrone Änderung der Berechnungsformel.

3、Da das Reagenz eine gewisse Konzentration an Protein enthält (ca.1 mg / mlDaher muss bei der Bestimmung der Proteinkonzentration in der Probe subtrahiert werden.Reagenz 1Der Proteingehalt.

Experimentelle Beispiele:

1、取0.1gMäusenleberbeitreten1 mlReagenz 1 und10μLReagenz 2, voll mit einem Eisbad-Homogenizer oder einem Grill-Homogenizer geschliffen,4℃、11000gZentrifugieren10 MinutenEntfernen Sie das Eis, folgen Sie den Messschritten,Spuren QuarzschalenMessungberechnenΔAMessung=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923，ΔALeer=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011Berechnen Sie das Enzym nach der Probenmasse:

PDHAktivität(U/g)Qualität= 913,81×(ΔA)Messung-ΔALeer÷W = 1747 U/gQualität.

Verwandte Publikationen:

[1]Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Seltene Ginsenoside verbessern die durch Lipid-Überlastung induzierte Insulinresistenz des Myokards durch Modulierung der metabolischen Flexibilität [J]. Phytomedizin, 2019, 58: 152745.

Referenzen:

[1]Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 lokalisiert sich auf Mitochondrien und verbessert die Pyruvatdehydrogenase-Aktivität in Skelettmyotube[J]. Mitochondrien, 2009, 9(4): 266-272.

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