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　　Schnelle Optimierung von PNA-Synthesebedingungen mit PurePep Chorus für mehrere Kanäle

Peptidnukleinsäure (PNA) ist ein DNA-Analog eines polypeptidoiden Skeletts mit einer Vielzahl von physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das Hauptkettenschelett von PNA besteht aus einer Verbindung von N(2-Aminoethyl)-Glycin mit einer Nukleinsäurebase über Submethylalkyle.

Abbildung 1: Strukturschema der Peptidnukleinsäure und Bindung an die DNA

Nichtionische Nukleensäureanaloge, da PNA keine negative Ladung hat, es keine elektrostatische Abwehr zwischen DNA und RNA gibt, so dass die Stabilität und Spezifizität der Bindung erheblich verbessert ist, die Hybridisierungsfähigkeit mit DNA oder RNA-Molekülen ist weit besser als DNA / DNA oder DNA / RNA, zeigt sich durch eine hohe Hybridisierungsstabilität, eine ausgezeichnete Fähigkeit zur Erkennung spezifischer Sequenzen, nicht durch Nuklease und Protease hydrolysiert.

PNAs können die Genexpression durch die Komplementierung von RNAs hemmen. Unter bestimmten Bedingungen kann auch die Genexpression durch die Bindung eines Ketteninvasionsmechanismus an eine doppelkettige DNA-Sequenz gefördert werden. Aufgrund der oben genannten Vorteile wurden PNAs seit fast einem Jahrzehnt in vielen Bereichen weit verbreitet und ihre hohe Affinität und Spezifikation machen sie nicht nur zu therapeutischen Mitteln, sondern auch zu mächtigen Werkzeugen in diagnostischen Anwendungen.

Mit der kontinuierlichen Vertiefung der Grundlagenforschung von PNA und dem Aufkommen neuer Technologien wird PNA eine bessere Leistung und breitere Anwendungsmöglichkeiten zeigen.

　　Aktuelle Herausforderungen

Aufgrund der leichten Polymerisierung während der Synthese und der vielen Nebenreaktionen beim Desprotektionsprozess stellt die Synthese von PNAs eine größere Herausforderung dar. Bei Problemen mit leichter Aggregation besteht die übliche Strategie darin, eine Überdosis von Reagenzien in der Koncentrationsreaktion zu verwenden. PNA-Monomeren für den synthetischen N-Endschutz sind jedoch relativ preiswert und diese Methode ist nicht weit verbreitet. Daher müssen relativ kostengünstige Syntheseverfahren entwickelt werden, um PNAs erfolgreich zu vermarkten.

　　Optimierung der Synthesebedingungen auf PurePep Chorus

In diesem Artikel zeigen wir eine schnelle Optimierung der Synthesebedingungen von PNA auf dem PurePep Chorus Synthesizer.

PNA 1 wird als Referenzsequenz verwendet, um verschiedene Syntheseparameter wie den Überdosierungskoeffizienten von PNA-Monomeren, die Reaktionszeit und die Temperatur zu untersuchen. Die Synthese von PNA-1 unter den höchsten Reinheitsbedingungen wird verwendet, um die Synthese von fünf anderen Sequenzen mit unterschiedlichen Längen und Purinen (Adenin und Vogdinin) Gehalt (siehe Tabelle 1). Die Reinheit ist ein Schlüsselfaktor bei der Untersuchung der Synthese, da das PNA-Monomer aufgrund seiner großen Raumblockade leicht zu einer Kondensionsreaktion führt, die nicht vollständig zu einer niedrigen Reinheit führt.

Tabelle 1: PNA-Sequenzinformationen in diesem Fall

PNA 1 wurde mit einem PurePep Chorus-Polypeptidsynthesizer mit einem synthetischen Äquivalent von 25 μmol mit einem Rink Amide MBHA-Harz mit einem Ersatz von 0,27 mmol/g und dem Fmoc/tBu-orthogonalen Schutzschema synthetisiert. Entschützung der Fmoc-Gruppe auf dem Harz mit einer 20%igen Pipidin-DMF-Lösung und Reaktion bei Raumtemperatur 5 min x 2 mal; Die Abstraktionsreaktion verwendet HCTU und NMM-Systeme, die spezifischen Reaktionsdetails in Tabelle 2. Durchführen Sie die Operation des Verschlusses nach dem Ende der Kondensationsreaktion mit einer 10%igen Essigsäureanhydrid-DMF-Lösung und reagieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur. Nach Abschluss des letzten Abschützungsschritts wird das Harz in der Schneidflüssigkeit (TFA: TIS: H2O = 95: 2,5: 2,5) gelegt und 4 Stunden bei Raumtemperatur reagiert.

Diese Operationen ermöglichen die Einstellung unterschiedlicher Protokolle in der Software auf Chorus je nach den gewünschten Bedingungen. Die Software berechnet automatisch die erforderliche Dosis, das Instrument läuft automatisch, was die Einsparung von menschlichem Betrieb erhöht und sicherstellt, dass das Testprogramm strikt durchgeführt wird.

Tabelle 2 Studie der Konditionen

Aus der Datenanalyse in Tabelle 2 können wir feststellen, dass die Reinheit der Rohstoffe des Produkts 81% erreicht, wenn die Reaktionsquote von PNA 10-mal beträgt; Aufgrund des hohen Monomerpreises des synthetischen Rohstoffs Fmoc-PNA ist das obige Design jedoch nicht einfach akzeptabel. Verringerung des Reaktionsexequenzkoeffizienten von PNA auf das Vierfache und Verringerung der Reinheit der Rohstoffe auf 72 %. Beim Aufrechterhalten des Reaktions-Äquivalentkoeffizienten von PNA auf das Vierfache, der Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 45 ° C und der Verkürzung der Kondensationszeit auf 5 Minuten wird die Reinheit des Rohstoffs weiter auf 61% gesenkt. Daher ist die Reaktionszeit von 5 Minuten für die Koncentrationsreaktion zu kurz. Zu diesem Zeitpunkt waren die anderen Bedingungen unverändert und die Reaktionszeit wurde allein auf 10 Minuten erhöht (Versuch D), wobei die Rohpeptidreinheit 82% erreichte, was den Ergebnissen von Versuch A ähnlich war. Versuch E wurde verwendet, um die Reaktionsbedingungen weiter zu untersuchen, wobei der Äquivalentkoeffizient auf 2 angepasst wurde und die Reaktion zweimal probiert wurde. Bei der Verwendung der gleichen Gesamtmenge an Reaktionsstoffen und bei der gleichen Kondensationszeit wurde die Reinheit der Rohstoffe um 5% erhöht.

Wir haben die Synthesebedingungen basierend auf den höchsten Werten der Reinheit des PNA-1-Produkts bestimmt, und die verbleibenden Sequenzen werden auf die gleiche Weise wie PNA-1 synthetisiert (Methode E). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt:

Tabelle 3: Rohstoffergebnisse für die Synthese der übrigen 5 PNAs mit Methode E

Die Rohreinheit der oben genannten fünf PNA-Nachsyntheseprodukte liegt zwischen 66-91%, was ein zufriedenstellendes Ergebnis für die Peptidnukleinsäure ist. Interessanterweise weisen PNA-Produkte mit höheren Puringehalten eine höhere Reinheit auf.

Abbildung 2: Chromatogramm von fünf PNA-Produkten, die mit dem UPLC-UV-System bei einer Wellenlänge von 210 nm erfasst wurden. Das UPLC-System ist ein Waters H-Klasse UPLC/ESI-MS mit einer C18 (1,7 μm, 2,1 x 50 mm) Chromatografie. Die Flussphase beträgt 0,1% TFA in einer Lösung von Wasser (A) und Acenitril (B) gemischt.

　　Zusammenfassung

In dieser Anwendungsliteratur erläutern wir detailliert, wie die PNA-Synthese mit dem PurePep Chorus-System optimiert werden kann. Zunächst haben wir die 10-fache Reaktions-Äquivalent von PNA für eine Stunde bei Raumtemperatur kondensiert, so dass eine Methode, die eine Reinheit von bis zu 81% des Produkts Rohstoffe zu erhalten. Wir verpflichten uns, die Menge an Reagenten zu reduzieren und ihre Auswirkungen auf die Reinheit der Rohstoffe zu minimieren, um die Reaktion wirtschaftlicher, nachhaltiger und grüner Chemie zu machen. Schließlich haben wir eine Methode entwickelt, die sowohl die Reagentmenge reduziert als auch die Reinheit erhöht. Mit der Methode der zweimaligen Konzentration, jede Probenahme mit dem doppelten Reaktionsübjekt, die 5 Minuten bei 45 ° C reagiert, kann die Rohstoffreinheit von PNA 1 von 81% auf 87% erhöht werden. Schließlich wurde diese Methode auf die Synthese von fünf anderen PNAs angewendet.

Für Peptidnukleinsäuren mit unterschiedlicher Länge und unterschiedlichem Puringehalt kann diese Methode sehr gute Produkte erhalten. Der PurePep Chorus Polypeptide Synthesizer ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für diese Arbeit, da das Syntheseschema flexibel auf Bedarf angepasst werden kann; Ändern Sie z. B. Reaktionskoeffizienten, Wiederholungen, Temperaturen und Zeiten. Gleichzeitig helfen die automatisierten Berechnungsfunktionen automatisierter Instrumente und Software, manuelle Handlungen zu reduzieren, das Fehlerrisiko zu reduzieren und die optimierten Synthesebedingungen können leicht auf die Synthese anderer PNAs angewendet werden.