Die Entwicklung von Impfstoffen, von der Forschung und Entwicklung über die frühe präklinische Forschung bis hin zur kommerziellen Produktion, Tests und Chargenfreigabe, umfasst umfangreiche Analysen und Tests, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Impfstoffen zu gewährleisten. Die Bioanalyse bei der Entwicklung von Impfstoffen stellt Herausforderungen in Bezug auf die Probenmatriz, die Art des Analyten und die Effizienz des Arbeitsablaufs dar, z. B. die für die Analyse verwendeten Impfstoffproben unterscheiden sich erheblich und die Auswahl an Analyten umfasst Polysaccharide, Proteine und Peptide, die in verschiedenen Matricen getestet werden müssen. Darüber hinaus beinhaltet die neue Generation von Impfstoffen eine wachsende Anzahl von Antigenen, wie z. B. HPV-Impfstoffe, die bivalent, quaternativ und neunvalent sind, was die Komplexität des Tests erheblich erhöht. Immunanalysen werden häufig zur Bestimmung der Titer, Reinheit und Wirksamkeit von Impfstoffen sowie ihrer immunogenen Reaktionen bei Tieren und Menschen verwendet, und die ELISA-Immunanalyse auf der Grundlage von porösen Platten ist zu einer der Goldstandard-Techniken in der Impfstoffbioanalyse geworden, einschließlich quantitativer Antigen-Epitope, Beurteilung von Verunreinigungsspiegeln und Überwachung der Titer und Immunogenität bei der Entwicklung von Impfstoffen. Die zunehmend dringenden Projektzeitpläne veranlassten die Forscher jedoch, nach Verbesserungen der Impfstoffimmunanalyse zu suchen, einschließlich:

Verwenden Sie weniger wertvolle Reagentien wie Impfstoffkandidaten sowie Proben von kleinen Versuchstieren

Testmethoden ermöglichen die einfache Bearbeitung von Serum- und Plasmaproben, Aluminium- und Ölemulsionen

Verringerung der Handbetriebszeit

Verringerung der Entwicklungszeit für Testmethoden

Gyrolab ® Das System bietet eine Lösung für diese Anforderungen und bietet viele zusätzliche Vorteile bei der Entwicklung von Impfstoffen. Die offene Plattform von Gyrolab unterstützt die schnelle Testentwicklung einer Vielzahl von Analysaten, Probentypen und Rezepturen und bietet Ready-to-Use-Kits für eine Vielzahl von Anwendungen. Gyrolab bei Bioaffy ™ Nano-Upgraded-Immundetection in Microfluidic-CDs minimiert Störungen aus einer Vielzahl von Substraten und ein geringer Proben- und Reagenzverbrauch kann die Anforderungen der neuesten Generation von Impfstoffen und kleinen Tierversuchen erfüllen; Die parallele Analyse mehrerer Analyten durch hohe Durchsatz- und Automatisierungsmodus reduziert die Praxiszeit erheblich und ermöglicht die schnelle Bereitstellung von Daten, die Erfüllung anspruchsvoller Projektzeitpläne und die schnellere Entscheidungsfindung. Die Gyrolab Software Workstation erfüllt die Anforderungen von 21 CFR Teil 11 und entwickelt Prüfmethoden und Daten, die den regulatorischen Anforderungen entsprechen und reibungslos zwischen Pharmafabriken und CROs übertragen werden können.

　　Dieser Artikel beschreibt mehrere Anwendungsfälle, bei denen das Gyrolab-System zur Verbesserung der Leistung und Effizienz der Impfstoffentwicklung verwendet wurde, um die Vorteile des Gyrolab-Systems in der Praxis zu veranschaulichen.

Fall 1:Detektion von antigenspezifischen Antikörpern im Serum innerhalb von 1,5 Stunden

Die Anzahl und Qualität von Antikörpern, die durch die Gedächtnis-B-Zellen (MBC) von Impfstoffen produziert werden, ist der Schlüssel zu verstehen, wie lebenslange schützende Antikörper induziert werden können. Die relative Frequenz der menschlichen peripheren Blut-Antigen-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen wird in der Regel durch eine serielle begrenzende Verdünnung Assay (sLDA) und ELISA-Analyse von Zellkulturen bestimmt, aber diese Methode ist zeitaufwendig und aufwendig für viel experimentelles Material, daher haben die Forscher von Novartis für die Entwicklung von Impfstoffen und Diagnosen ELISA-Immunoassays auf das Gyrolab-System übertragen, um die Produktion zu erhöhen. Das Ziel der Studie war es, Mäuse zu impfen, die das Neisseria-Antigen mit drei Hilfsmitteln kombiniert hatten, um den IgG-Subtyp zu bestimmen, der von den Memory-B-Zellen der Mäuse produziert wurde, durch Immunotests. Die Forscher haben zwei Arten von Tests getestet:

　　Direkte Prüfung (Direct Assay)

Zur Beurteilung: ① die Fähigkeit des biotinierten Antigens, sich an die Mittelkettenmycin-Affinitätssäule von Gyrolab Bioaffy Microfluidic CD zu binden und spezifische IgG zu erfassen; ② Erkennung der Empfindlichkeit der antigenspezifischen Antikörper in der Zellkultur-Oberflüssigkeit; Anhand der Bindungskurve im Gyrolab Viewer wird die Affinität der Bindung von Antikörpern an bestimmte Antigene bewertet.

　　Umkehrtes Testen (Reverse Assay)

Die Fähigkeit des Alexa-Fluoreszenzmarkers, spezifische IgG zu erkennen, die an eine CD-Affinitätssäule binden, zu bewerten.

Direkte Assay

Abbildung 1: Der Gyrolab-Test und ELISA identifizierten die gleichen positiven und negativen Proben in einer Serum auf einer B-Zellkultur von Testmäusen, die mit Nesser impft wurden. Die Y-Achse ist die Titer des Antikörpers, der von Gyrolab getestet wurde, und die positiven Proben, die durch ELISA identifiziert wurden, sind mit grünen Feldern gekennzeichnet.

Die Gyrolab-Direktdetektion ermöglicht die gleichzeitige Detektion von Antikörpern verschiedener IgG-Subtypen in einigen Mikrolitern Probe.

Der antigenspezifische Antikörper-Test auf einem Gyrolab-System hat im Vergleich zu ELISA viele Vorteile, da nur ein paar Mikroliter Proben benötigt werden, um die Qualität der Antikörper-Reaktion zu analysieren, nämlich die relative Anzahl der IgG-Subtypen.

Fall 2:Reagenzscreening - Vergleich von Impfstoffpartien für Freigabetests

Die Bioanalyse von multivalenten Impfstoffen wird immer komplexer und erfordert die Entwicklung einer Vielzahl von Testmethoden. Da multivalente Impfstoffe mehrere Antigene enthalten, müssen Freisetzungstests für jede Antigenkomponente entwickelt werden, um Dosis und Wirksamkeit zu gewährleisten, muss die Anzahl der Tests für jedes Produkt mit der Anzahl der Antigene multipliziert werden. Das Entwicklungsteam für Impfstoffanalysen von Merck in den USA hat eine hochflexible Gyrolab-Testmethode entwickelt, die die Entwicklung von multivalen Impfstofftests und den Reagenzverbrauch (z. B. markierte Testantikörper usw.) minimiert. Die Methode basiert auf biotiniertem Ziege-Anti-Maus-IgG, das an einer Kettenschimmel-Fillin und einer Säule von Gyrolab Bioaffy CD befestigt ist, nachdem ein Analytikspezifischer Erfassungsantikörper (z. B. Maus-α-PS-mAb) hinzugefügt wurde und die Probe anschließend mit einem zweiten Analytikspezifischen Antikörper (z. B. Kaninchen-α-PS-pAb) getestet wurde, um das gefangene Analytik schließlich mit Alexa Fluor zu erkennen. ® 647 markierte Esel Anti-Kaninchen Antikörper wurden fluoreszierend getestet (Abbildung 3). Diese 5-Schicht-Test-Form mit "doppelter Klemme" erfordert keine Kennzeichnung eines spezifischen Analyten-spezifischen Reagents, das leicht ersetzt werden kann, so dass es nur eine minimale Entwicklung erfordert, um den Nachweis von polyvalenten Zucker- und polyvalenten Protein-Impfstoffen sowie die Unterschiede zwischen den Chargen von Anti-Serum anzuwenden.

Abbildung 3. 5 Schichten "Doppelklemme" Gyrolab-Erkennungsform. PS: Zuckeranalyte

Der Gyrolab-Test wurde verwendet, um zwei Anti-Serum-Chargen gegen drei Antigene zu vergleichen. Mit dem Softwaremodul Gyrolab Viewer können die kombinierten Reaktionen jedes Datenpunkts auf der Affinitätssäule in einem CD-Mikrokanal visualisiert werden, wodurch die Daten mit einer zeitaufwendigeren Leistungskurve vergleichbar sind (Abbildung 4).

Panel A: Vergleich der Antiserum-Chargen von Antigenen A, B und C mit Fluoreszenz-Intensitätsdaten (links) und der Reaktionskurve (rechts). Panel B: Der Gyrolab Viewer von Antigen B kombiniert ein Bild der Intensitätskurve und zeigt eine niedrigere Fluoreszenzintensität auf den Säulen der neuen Charge und eine erhöhte Spitzenverlagerung, was darauf hindeutet, dass die Antikörper-Affinität für diese Charge niedriger ist als für die alten Chargen.

Obwohl die beiden Chargen ähnlich gegen Antigen A wirken, leisten die alten Chargen besser gegen Antigen B, mit einer größeren Spitzenfläche, die im Gyrolab Viewer kombiniert wird, und einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis bei der Titration. Neue Chargen zeigen eine deutliche Fluoreszenz-Nachlass auf der Säule, was eine niedrigere Affinität mit Antigenen anzeigt. Bei Antigen C zeigten beide Antiserum-Chargen eine deutliche Verzögerung, während die alten Antiserum-Chargen eine höhere Spitzenverlagerung zeigten. Bei der Titration ist der Hintergrund der alten Charge höher und das Signalräusch geringer. Daher bietet die Visualisierung des Gyrolab Viewers in Kombination mit Spektrogramm, Reaktionskurve und Signal-Rausch-Verhältnis wertvolle Erkenntnisse zum Verständnis von Antiserum-Batches.

Das Team von Merck kam zu dem Schluss, dass das Gyrolab-System wertvolle statistische und grafische Daten liefert, die zusammen mit den auf porösen Platten basierenden Prüfdaten ausgewertet werden, sowie zusätzliche Vorteile wie schnelle Umsatzzeiten, hohe Durchsatzleistungen und die Fähigkeit, die Stärke der Visualisierung zu kombinieren.

Fall 3:Quantitativen dynamischen Bereich der Antigen-Titration auf 4 Logs erweitert

Unternehmen, die Impfstoffe entwickeln, müssen den dynamischen Bereich der Immunoassays erweitern, um Zuckerproteinantigene zu messen, die an Aluminium-Zusatzstoffen adsorbiert werden. Die Forscher übertragen die ELISA auf das Gyrolab-System und erweitern den dynamischen Bereich von 5-300 mIU / ml auf ~ 0,6-40 000 mIU / ml, wobei der Gyrolab-Test sowohl die obere als auch die untere quantitative Grenze erweitert.

Abbildung 5. Gyrolab bietet eine leistungsstarke Detektionsmethode, die den dynamischen Bereich bei der Messung der Antigentiter erheblich erweitert.

Fall 4:Impfstoffwirksamkeitsstudien zur Unterstützung der Entwicklung von Rezepturen

Die Beurteilung der Konsistenz der Wirksamkeit zwischen den Chargen ist ein wichtiger Bestandteil der Impfstoffqualitätskontrolle. Effektivitätstests können zur Stabilitätsstudie, zur Validierung und Optimierung von Fermentations- und Reinigungsprozessen, zum Vergleich neuer und alten Anlagen sowie zur Bewertung der Wirkung von Rezeptur- oder Zusatzstoffänderungen verwendet werden.

Die US-amerikanische Firma Merck verglich die Leistung des Gyrolab-Systems mit dem Luminex-Test in Mäusenproblemen. Die Studie umfasste in-vivo-Immunität bei Mäusen, die normalisierte Antigenproben auf einen Dosiskonzentrationsbereich von 6-12 verdünnten. Die wirksame Dosis (ED50) wird auf der Grundlage der maximalen Dosis bestimmt, die 50% der Serumkonversion von Mäusen in jeder Dosierungsgruppe erreicht hat, und bis zu 220 Mäusenserumproben sind erforderlich, um einen ED50-Wert zu erzielen, so dass diese mühsame Arbeit eine große Menge an kleinen Proben erfordert. Der Gyrolab-Test hat sich als zuverlässig und robust erwiesen, seine Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit (CV < 10%) sind vergleichbar mit der Luminex-Messung (R2 = 0,97), aber mit kürzeren Betriebszeiten und schnelleren Umsatzzeiten.

Abbildung 6. Der Gyrolab-Test ist hoch wiederholbar, CV<10%

Abbildung 7. Vergleichbare Ergebnisse von Gyrolab und Luminex