SILAC Metabolische Markierungen Quantitative Experimente

SILAC Metabolische Markierungen Quantitative Experimente

Das Grundprinzip von SIL AC besteht darin, die entsprechenden Aminosäuren im Zellkulturmedium durch natürliche Isotope (leichte) oder stabile Isotope (schwere) gekennzeichnete essentielle Aminosäuren zu ersetzen. Nach 5-6 Vervielfältigungszyklen werden die Aminosäuren* mit stabilen Isotopen in das neu synthetisierte Protein der Zelle integriert, um die ursprünglichen Aminosäuren zu ersetzen. Die Lyseproteine verschiedener markierter Zellen werden in Verhältnissen wie Zellzahl oder Proteinmenge gemischt, nach Isolierung und Reinigung durch Massenspektrometrie und relative Quantifizierung basierend auf dem Flächenvergleich zweier Isotoppeptidsegmente in einem Massenspektrum der ersten Stufe. Es gehört zur in-body metabolischen Markierungsmethode.

Experimentelle Betriebsprozesse:

1. Proteinextraktion und Probenvorbereitung

2. Kennzeichnungseffizienzprüfung

3. Probenmischung

SDS-Page Bewertung

5. Enzyme

6. Massenspektrometrie

7. Software-Analyse

Qualitative und quantitative Proteomenergebnisse

9. Bioinformatik Data Mining und statistische Analyse

Experimentale Hinweise:

Kunden bieten:

1. Proteinextrakt: Konzentration > 1 μg / ul, Gesamtproteinmenge > 300 μg.

Zellen: Nehmen Sie nicht weniger als 2x106 Zellen in einem EP-Röhrchen durch die Zellzahl, fügen Sie 0,5 ml physiologisches Salzwasser oder Proteinschutzmittel hinzu und lagern Sie es im Kühlschrank (-80 ° C, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden).

Lieferstandard:

1. Protein-Identifizierung und SIL AC quantitative Analyse Ergebnisse;

2. KundenanweisungMassenspektrum-Spitzenkarte der Protein-Entsprechung;

3, SIL AC Experiment vollständige experimentelle Schritte, die Verwendung von Instrumenten, Software-Abrufparameter usw.

Sonstiges:

SILAC ist eine in vivo-Markierungstechnologie, stabile Isotope-markierte Aminosäuren und natürliche Aminosäuren haben im Wesentlichen die gleichen chemischen Eigenschaften, markierte Zellen und nicht markierte Zellen haben kaum Unterschiede im biologischen Verhalten, die Markierungseffizienz kann bis zu 100% sein.

2, Massenspektrum-Quantifizierung, die quantitativen Ergebnisse sind genau und die Batch-Variationen sind klein und wiederholbar.

In vitro-Metabolik-Marker in Kombination mit SDS-PAGE oder Chromatometrie-Isolation-Technologie, kompatibel mit hydrophoben Proteinen und paraalkalischen Proteinen, nicht durch Proteineigenschaften eingeschränkt.

Nach der Mischung mehrerer Proben werden gleichzeitig Trennung, Enzymschnitt und Identifizierung durchgeführt, und die Auswirkungen der nachfolgenden Experimente auf die Probe sind konsistent, was die Auswirkungen des experimentellen Betriebs und der Instrumentausrüstung verringert.

Da die Technologie in vivo markiert ist, ist die Markierungswirkung stabil, und ihre Markierungseffizienz wird nicht von der Lysate beeinflusst, ist sie nicht nur für die Analyse von ganzzelligen Proteinen geeignet, sondern auch für die Identifizierung und Quantifizierung von Membranproteinen geeignet.

Im Vergleich zu chemischen Markern reduziert sich der Proteinbedarf der SIL AC-Methode deutlich, in der Regel benötigen Sie nur ein paar Dutzend Mikrogramm Protein pro Probe.

7, lebendige Markierung, näher an den wahren Zustand der Probe.

8, nur für lebende Zellen geeignet, für die häufig in der biomedizinischen Forschung verwendeten Gewebeproben, Körperflüssigkeitsproben usw. können nicht analysiert werden, und die Markerkosten für Tiermodelle sind zu hoch, können nicht erreicht werden. SIL AC gehört im Vergleich zur in vitro-Markierungstechnologie zu den in vitro-Markierungen und hat die folgenden technischen Vorteile:

1, hoher Durchfluss, kann gleichzeitig Hunderte bis Tausende von Proteinen identifizieren und quantifizieren;

2. Quantitative Präzision* & GenauigkeitVerringerung der experimentellen Unterschiede aufgrund unterschiedlicher Probenbereitung;

Breiter linearer Quantifizierungsbereich;

4, höhere Empfindlichkeit, deutlich reduzierte Proteinbedarf;

5, die Kennzeichnung verwendet die in-vivo-Kennzeichnungstechnik, näher an den wahren Zustand der Probe.

SILAC technische Dienstleistungen

1. Zellisotop-Markierung;

SDS-PAGE Trennung;

4. Flüssige Phase-Isolation und Massenspektrometrie nach Panenzym-Schnitt;

Datenbanksuche und quantitative Proteinanalyse;

Bioinformatische Analyse von Differenzproteinen;

7. Versuchsbericht vorgelegt.

Bericht über Experimente

1. Protein-Identifizierung und SIL AC quantitative Analyse Ergebnisse;

2. KundenanweisungMassenspektrum-Spitzenkarte der Protein-Entsprechung;

3, SIL AC Experiment vollständige experimentelle Schritte, die Verwendung von Instrumenten, Software-Abrufparameter usw.

Vorteile des technischen Services

1, hohe Empfindlichkeit, niedrige Detektionsgrenze, kann eine niedrige Fülle an Proteinen erkennen;

2, starke Isolationsfähigkeit, breiter Analysebereich, iITRAQ kann jede Art von Protein isolieren, einschließlich hochmolekularer Proteine, saurer und alkalischer Proteine, Membranproteine und unlöslicher Proteine;

Hoher Durchfluss: 8 Proben werden gleichzeitig analysiert, um den experimentellen Durchfluss zu verbessern und mehrere Zeitpunkte oder verschiedene Proteine gleichzeitig zu analysieren;

Zuverlässige Ergebnisse: qualitative und quantitative Analyseergebnisse sind zuverlässiger;

Hoher Automatisierungsgrad: Flüssige Phase und Massenspektrum, automatisierte Operation, schnelle Analysegeschwindigkeit, gute Trennungseffekte.

Experimente im Dienst: