Apoptose-Faktor Caspase-389 Tests

Apoptose-Faktor Caspase-389 Tests

Kaspase3

KaspaseEs ist eine Protease-Familie, die eine wichtige Rolle bei der Apoptose spielt. Caspase3, auch CPP32 genannt, ist ein Schlüsselenzym bei der Apoptose, das Procaspase 2.6, 7 und 9 schneiden kann und viele Caspase-Substrate direkt spezifisch schneiden kann, einschließlich PARP (poly(ADP-ribose) polymerase), ICAD (Inhibitor of caspase-activated Deoxyri- bonuclease), gelsolin und Fodrin usw. Diese durch Caspase 3 vermittelten Proteinschnitte sind ein wichtiger Bestandteil des molekularen Mechanismus der Apoptose. Caspase 3 spielt auch eine Schlüsselrolle bei der Nukleaoptose, einschließlich der Chromatoplastik.

Verkürzung, Fragmentierung der DNA usw. Caspase 3 spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Zellblöbung.

Das Testprinzip basiert auf Casepase 3, die das Substrat AC-DEVD-pNA zur Herstellung gelbes pNA (-itroanilin) katalysiert, wodurch die Aktivität von Casepase 3 durch die Messung der Absorption nachgewiesen werden kann. pNA hat eine starke Absorption in der Nähe von 405nm. Die Standardkurve, die mit Bezug auf das gelbe Produkt pNA hergestellt wird, kann als Standardprodukt für die quantitative Kaspase-3-Enzymaktivität dienen.

Kaspase-8

Caspase 8 ist in der Regel in Form von Enzymen vorhanden und wird während der Signalisierung der Apoptose aktiviert, Caspase 8 wird als Upstream-Caspase in der Apoptose-Signalisierung angesehen, während Fas-Rezeptor und TNFR-1 vermittelte Apoptose aktiviert wird, um ein Dimer aus p18 und p10 zu bilden, das die nachgelagerte Caspase 4, Caspase 6, weiter aktiviert. Caspase 9 und Caspase 10 Diese Methode basiert darauf, dass Caspase 8 das Substrat AC-IETD-pNA zur Herstellung gelbes pNA (-Nitranilin) katalysiert, wodurch die Aktivität von Caspase 8 durch Absorptionsmessung nachgewiesen werden kann. pNA hat eine starke Absorption in der Nähe von 405nm. Der OD-Wert von 405 nm für die Probe wurde unter Berücksichtigung der von pNA erzeugten Standardkurve ermittelt, um die Caspase-8-Enzymaktivität der Probe zu berechnen.

Kaspase-9

Caspase 9 ist auch bekannt als ICE-LAP6 oder Mch6.ApoptoseUpstream Caspase während der Signalwandlung. Nachdem die Mitochondrien Zytochrom C freigeben, kann Caspase 9 mit Zytochrom C und Apaf1 gleichzeitig aktiviert werden. Aktivierte Caspase 9 aktiviert das kritische Enzym Caspase 3 für die Apoptose und fördert somit die nachfolgende Signalisierung der Apoptose. Die Aktivierung von Caspase 9 kann durch Phosphorylation reguliert werden.

Diese Methode basiert auf Caspase 9, die das Substrat Ac-LEHD-pNA katalysiert, um ein "rauges gelbes pNA (p-Nitroanilin) zu erzeugen, das durch die Messung der Absorption nachgewiesen werden kann.

Aktivität von Caspase 9. pNA hat eine starke Absorption in der Nähe von 405nm. Der OD-Wert von 405 nm für die Probe wurde unter Berücksichtigung der von pNA erzeugten Standardkurve ermittelt, um die Caspase-9-Enzymaktivität der Probe zu berechnen.

Kaspase1

Kaspase2

Kaspase4

Kaspase6

Absolutionsfaktor Caspase3/8/9 Prüfvorbereitung:

1) Zellproben: Nehmen Sie 1x107 Zellen (ungefähr 1 T25 Kulturflaschenzellmenge), 600 g 4 ° C Zentrifugieren, um die Zellen für 5 Minuten zu sammeln, sorgfältig das Oberwasser zu absorbieren und einmal mit PBS zu waschen. Nach der Absorption der Oberreinigung wird jede Röhrenzellprobe mit 100u|Lysate resuspendiert und ein Eisbad für 15 Minuten geklattet. 4 ° C 16.000 g Zentrifugieren für 10-15 Minuten und übertragen Sie das Oberwasser in ein Eisbad vorgekühltes Zentrifugerrohr. Messung der Enzymaktivität von Caspase 3 sofort oder eine Probe bei -70 ° C aufbewahren. Gleichzeitig können kleine Mengen an Proben mit der Bradford-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration genommen werden, um die Proteinkonzentration auf 1-3 mg / ml zu erreichen.

2) Gewebeprobe: Ungefähr pro 10 mg Gewebe werden 100 ul Lysate hinzugefügt und mit einem Glas-Homogenator im Eisbad homogenisiert. Dann übertragen Sie die homogene Slurry in 1,5 ml) Zentrifugerrohr, und das Eisbad spaltet für weitere 5 Minuten. 4 ° C 16.000 g Zentrifugieren Sie 10-15 Minuten und übertragen Sie das Oberwasser in ein Eisbad vorgekühltes Zentrifugerrohr. Immediate Bestimmung der Enzymaktivität von Caspase 3 oder -70 ° C Aufbewahrung

Proben. Gleichzeitig können kleine Mengen an Proben mit der Bradford-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration genommen werden, um die Proteinkonzentration auf 1-3 mg / ml zu erreichen.

Standardkurve zur Erkennung von Caspase-3-Aktivität

Versuchszeitraum: 7-10 Werktage abgeschlossen, wiederholte Testangebote.

Aufmerksamkeit der Kunden

Antikörper: VorberatungShanghai ForschungBiologische, eindeutige Antikörper-Gattung und ob der Antikörper verfügbar ist. Wenn dies nicht von den Parteien verhandelt werden kann, kann der Kunde das Angebot selbst kaufen oder in Auftrag unseres Unternehmens kaufen;

Sammlung und Aufbewahrung der Proben:

1 Gewebeprobe: frisches Gewebe in flüssigen Stickstoff oder 70 Grad aufbewahren, Gewebe nicht weniger als 100 mg (ungefähr grüne Bohnengröße);

② Kulturzellen: Nehmen Sie nicht weniger als 000000 Zellen in EP-Röhren durch die Zellzahl, fügen Sie 0,5 ml physiologisches Salzwasser oder Proteinschutzmittel hinzu und bewahren Sie es im Kühlschrank (-70 ° C, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden);

3. Blutzellproben: 0,5 ml physiologisches Salzwasser oder Proteinschutzmittel hinzufügen, um Blutproben mit Antikoagulation oder Lymphozyten-Isolation zu bewahren (-70 ° C kann langfristig aufbewahrt werden, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden)

Serum- oder Zellkulturflüssigkeitsproben: nach der Entfernung von Verunreinigungen durch Zentrifuge in ein EP-Röhrchen aufgenommen und aufbewahrt (über 4 ° C kann 15-20 Tage aufbewahrt werden, -70 ° C kann langfristig aufbewahrt werden, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden)

3, Probentransport: Sie können Proben auf eine der folgenden Methoden senden

① Gewebeproben, Zellproben werden mit Trockeneis transportiert oder mit Eisbeutel transportiert, nachdem Proteinschutzmittel hinzugefügt wurden;

② Zellproben können auch direkt in der Kulturflasche versendet werden (Dichtung garantiert keine Verschmutzung, Kulturflüssigkeit läuft nicht aus, Zellen wachsen nicht zu voll, etwa 50%, Kulturflüssigkeit füllen);

Serum oder Oberserum werden direkt mit Eisbeutel versendet (Dichtung gewährleistet, dass die Flüssigkeit nicht leckt, die Sichtweg kann fast 2-3 Tage erreicht werden).

Experimente im Dienst: