Protein-bidirektionale Elektrophoresis-Experimente

Einer,Protein-bidirektionale Elektrophoresis-ExperimenteTechnische Einführung zum Experiment

2D-WB ist eine Technologie, die eine bidirektionale Elektrophorese mit dem traditionellen Western Blot kombiniert. Allgemeiner Versuchsprozess Die Antigen-Proteinmischung wird zuerst durch bidirektionale Elektrophoresis isoliert, das Gelprotein wird dann auf die Trägermembran übertragen und dann durch Antikörper-Hybridisierung gefärbt. Die 2D-WB-Technologie kann kleine Veränderungen in Antigen-Isopunkten oder Molekulargewichten erkennen und hat gute Anwendungen in der Studie der Proteinmodifikation nach der Translation; In Kombination mit der Massenspektrometrie kann 2D-WB immunogenere Antigene aus Proteinmischungen finden.

Zwei,Protein-bidirektionale Elektrophoresis-ExperimenteÜbersicht

2D-WB ist eine Technologie, die eine bidirektionale Elektrophorese mit dem traditionellen Western Blot kombiniert. Allgemeiner Versuchsprozess Die Antigen-Proteinmischung wird zuerst durch bidirektionale Elektrophoresis isoliert, das Gelprotein wird dann auf die Trägermembran übertragen und durch Antikörper-Hybridisierung gefärbt. Die 2D-WB-Technologie kann kleine Veränderungen in Antigen-Isopunkten oder Molekulargewichten erkennen und hat gute Anwendungen in der Studie der Proteinmodifikation nach der Translation; In Kombination mit der Massenspektrometrie kann 2D-WB immunogenere Antigene aus Proteinmischungen finden.

III. Dienstleistungen

1. Proteinextraktion und Quantifizierung;

2. Elektrophoresis in zwei Richtungen;

3. Transformation, Schließen, Inkubieren, Bildgebung anzeigen.

4. Experimentelle Betriebsprozesse

1. Elektrophoresis (IEF), Gleichgewicht der Klebstreifen, zweite Elektrophoresis SDS-APGE.

2, nach dem Ende der zweiten Elektrophoresis, entfernen Sie das Gel für die Transformation, die Transformationsmethode kann die nasse Methode und die halbtrockene Methode wählen. Die häufig verwendeten Folien sind NC-Folien und PVDF-Folien.

5% entfettete Milchpulver oder 5% BSA für 1 Stunde (Raumtemperatur) oder über Nacht (4 Grad) geschlossen.

4, eine Inkubation, nach der Antikörper-Anleitung wählen Sie die Inkubationszeit, die üblichen Inkubationsbedingungen sind Raumtemperatur 1 Stunde oder 4 Grad über Nacht, eine Inkubation nach der Entfernung der Membran

TBST Waschen 3 Mal, je 5 Minuten.

5. Zweite Anti-Inkubation: Nach der Auswahl des geeigneten Zweiten Anti-Inkubation (Anti-Ratte, Anti-Mensch, Anti-Kaninchen usw.) nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wird die Membran TBST 3 Mal und jeweils 5 Minuten gewaschen.

6, Darstellung: A, B-Substrat proportional verdünnen Mischung gleichmäßig auf die Membran tropfen, in der Dunkelkammer die Folie auf die Membran, Abdecken Sie die Klemme, nach einer bestimmten Zeit der Belichtung die Folie in die Darstellungsflüssigkeit zur Darstellung, bis eine klare Proteinband erscheint, reines Wasser spülen Sie nach der Darstellung in der Darstellungsflüssigkeit, die Belichtungszeit muss die obere Probenmenge des Proteins, die Antikörper-Verdünnungskonzentration, die Antikörper-Inkubationszeit und andere Faktoren berücksichtigen.

7, nach der Festlegung, waschen Sie den Film, trocknen, markieren Marker, scannen Sie Bilder und 2D Western Blot Bildanalyse.

Um den reibungslosen Ablauf der 2D Western Blot-Technologie zu gewährleisten, muss der Versand der Proben die folgenden Anforderungen erfüllen:

1, Kunden liefern: Gewebe, Zellen, Proteinlösungen usw.; 1. Abwehr (kann im Auftrag der Forschungsfirma übergeben werden).

Transportanforderungen: Trockeneis oder flüssiger Stickstoff verpackung versendet.

Hinweis: Proben sollten alle Arten von Verschmutzung und wiederholtes Gefrierschmelzen vermeiden.

V. Inhalt des technischen Dienstberichts

1. Protein-Quantifizierungsergebnisse und Elektrophorese-Probenmenge;

2. Originalfilm, elektronische Bilder und Bildanalyse;

Vollständiger 2D-Western-Blot-Bericht, einschließlich der experimentellen Schritte, der Verwendung von Instrumenten und Reagentien.

Anhang: 2D Western Blot Experiment Schritte

Das Hauptprinzip der Vorbereitung von 2D-Western-Blot-Proteinproben besteht darin, das gesamte Protein so weit wie möglich zu lösen, die Wechselwirkung zwischen Protein und Protein zu zerstören, verschiedene Störungen zu vermeiden, die Probenvorbereitung ist mit IEF kompatibel und so weiter.

2, die wichtigsten Schritte der bidirektionalen Elektrophoresis, der zweite Elektrophoresis SDS-APGE.

3, nach dem Ende der zweiten Elektrophoresis, entfernen Sie das Gel für die Transformation, die Transformationsmethode kann die nasse Methode und die halbtrockene Methode wählen. Die häufig verwendeten Folien sind NC-Folien und PVDF-Folien.

Geschlossen, 5% entfettete Milchpulver oder 5% BSA geschlossen für 1 Stunde (Raumtemperatur) oder über Nacht (4 Grad).

5, Anti-Inkubation, nach der Antikörper-Anleitung wählen Sie die Inkubationszeit, die üblichen Inkubationsbedingungen sind Raumtemperatur 1 Stunde oder 4 Grad über Nacht, ein Anti-Inkubation nach dem Entfernen der Membran TBST 3 Mal, je 5 Minuten gewaschen.

6, Sekundäre Anti-Inkubation: Nach - Anti-Auswahl der geeigneten Sekundäre Anti-Inkubation (Anti-Ratte, Anti-Mensch-Kaninchen, etc.), nach Raumtemperatur Inkubation 1 Stunde entfernen Sie die Membran TBST Waschen 3 Mal, je 5 Minuten.

7, Darstellung: A, B-Substrat verhältnismäßig verdünnt und gleichmäßig auf die Membran getropft, in der Dunkelkammer den Film auf die Membran gelegt, die Folienklemme bedeckt, nach einer bestimmten Zeit der Belichtung den Film in die Darstellungsflüssigkeit gelegt, bis ein klarer Proteinband erscheint, Wasser gespült, nachdem er in der Darstellungsflüssigkeit festgelegt wurde, muss die Belichtungszeit das Protein berücksichtigen. Faktoren wie die Probenmenge, die Antikörper-Verdünnungskonzentration und die Antikörper-Inkubationszeit.

8, nach der Festlegung, waschen Sie den Film, trocknen, markieren Marker, scannen Sie Bilder und 2D Western Blot Bildanalyse.

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Sollten Sie aufgrund der Zeit, der experimentellen Bedingungen etc. nicht in der Lage sein, Ihre Studie abzuschließen, wenden Sie sich bitte an uns.

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