Multiklonale Antikörper-Vorbereitung

Multiklonale Antikörper-Vorbereitung

Multi-Anti allgemeine Vorbereitungsverfahren: * Antigen Vorbereitung - + Kaninchen Immunität - → Wirksamkeit Nachweis und Endrelease - + Antikörper Affinität Reinigung - + Konzentration und Konservierung von Antikörpern.

Die spezifischen experimentellen Schritte sind wie folgt:

1. Vorbereitung des Kaninchens

Wählen Sie zwei gesunde, sechs Wochen große weiße Kaninchen aus Neuseeland (ca. 2 kg), um sie an die neue Lebensumgebung anzupassen, um sie mindestens ein paar Tage zu stabilisieren, bevor Sie Blut entnehmen und Blut vornehmen (als negative Referenz)

1.1 das Kaninchen vorsichtig in ein festes Regal setzen, um das Kaninchen zu beruhigen;

1.2 Rasieren Sie vorsichtig das Haar auf dem Kaninchenohr, damit die Blutgefäße klar sichtbar sind (auch nicht rasiert werden können);

1.3 Wenn nötig, können kleine Baumwollkugeln mit Alkohol aufgetragen werden, um die Gefäße zu erweitern;

1.4 Entnehmen Sie mit einer Spritze etwa 10 ml Blut (etwa 5 ml Serum) aus der Ohrvene;

1.5 Ziehen Sie die Nadel vorsichtig aus, drücken Sie die Wunde richtig, um Blutungen zu vermeiden, und desinfizieren Sie die Wunde mit alkoholischen Baumwollkugeln;

1.6 das gesammelte Blut in 37 C für 30 min zu deaktivieren und dann in 4 'C über Nacht zu bringen, damit es koaguliert freisetzt Serum;

1.7 wird gutes Blut bei 10 min Zentrifuge bei 10000r / min gerinnen; h. Sammlung von Serum, also Serum.

Immunität des Kaninchens

2.1 Injektion von Antigen für zwei Kaninchen ist 1 ml, muss die Antigenpufferlösung kein schädliches chemisches Reagenz für Kaninchen enthalten. Jedes Kaninchen hat eine anfängliche Immunität von 400ug Antigen, das besser geeignet ist, kann auch angemessen reduziert werden, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

2.2 1 m Buddhist-Hilfsmittel mit dem vorbereiteten 1 m Antigen vollständig vermischt und milchweiß; .

2.3 Vorsichtig das Kaninchen aus dem Käfig zu entfernen, das Kaninchen immun 4 Teile (Rücken und Schenkel Wurzeln sind möglich), jede Stelle 250ul, Nadel in einem Winkel von 45 Grad unter die Haut 1-2cm eingefügt, nach der Injektion bleiben Sie einige Sekunden, um Antigen-Fluss zu verhindern.

2.4 Der Kaninchenkrankungszyklus dauert 20 Tage, 7-10 Tage nach der Immunisierung wird Blutentnahme (einschließlich Halbzeittest-Blutentnahme und Endblutung) durchgeführt, insgesamt 4-5 Immunisierungen.

3. Effizienzprüfung

3.1 2 Referenznegative Referenzen als vorgenommenes Blutserum, beide mit 1 Anti-Startkonzentration verdünnt (geschlossene Verdünnung); Positive Referenz zu früheren

Positives Serum

3.2 100 µl, 1 µg/m Antigen pro Loch in 96-Loch-Platte zu tropfen, über Nacht bei 49 ° C, kann auch für 2 Stunden bei 37 ° C inkubiert werden.

3.3 Gießen Sie die Antigenlösung und fügen Sie 200 µ geschlossene Flüssigkeit pro Loch, 49C über Nacht oder 379C inkubieren für 2 Stunden.

3.4 Gießen Sie die verschlossene Flüssigkeit, auf dem Absorbierpapier, um die Restflüssigkeit zu trocknen, waschen Sie die Platte dreimal mit der Waschflüssigkeit, um die Restflüssigkeit zu trocknen, um eine gewisse Zeit zu platzieren, 37 ° C trocknen und mit einer verschlossenen Tasche verschließen besser als 20 ° C lagern.

3.5 Packung ist gut 96 Loch Platte,第---Das Loch wird mit 100 µl negativer Referenzflüssigkeit versehen, das zweite Loch mit 100 µl positiver Referenzflüssigkeit versehen, das dritte Loch mit 1:500 zu messendem Antiserum versehen, anschließende Löcher werden auf dieser Basis verdünnt und 1 Stunde bei 37 °C inkubiert.

3.6 Gießen Sie die Flüssigkeit ab, waschen Sie die Platte dreimal mit Waschflüssigkeit und trocknen Sie. Zu jedem Loch wurden 100 µ HRP-gekennzeichnete Maus Anti-Kaninchen-lgG (1: 2000 Verdünnung) hinzugefügt und 45 Minuten bei 37 ° C inkubiert.

3.7 Gießen Sie die Flüssigkeit ab, waschen Sie die Platte dreimal mit Waschflüssigkeit und trocknen Sie. Zu jedem Loch werden 100 µ TMB-Substrat (Sigma Single Component TMB) bei 37 °C inkubiert und für 5-20 Minuten (die Anzeigezeit ist abhängig von der Farbe festgelegt).

3.8 50 µ Endflüssigkeit (2N H2SO4) pro Loch hinzufügen, um den Absorptionswert bei einer Wellenlänge von 450 nm auf dem Enzym-Skalierer zu lesen.

Nach einem Antikörper-Effektivitätstest von über 1 Million kann eine endgültige Blutverblutung des Kaninchens durchgeführt werden.

Reinigung von Antikörpern

4. Affinität von Antikörpern - Vorbereitung von Affinitätssäulen

4.1 1 1 mg CNBr-Sepherose 4B Gel mit 2 mmol / L Salzsäure, 4 'C über Nacht, um es vollständig auflösen, um 3m auflösenden Kleber zu erhalten.

4.2 Das Gel wird in eine Reinigungssäule übertragen und das Medium dreimal mit ca. 20 ml 2 mmol / L Salzsäure gewaschen.

4.3 Waschen Sie das Medium mit einem gekoppelten Puffer - mal, da die Aktivierungsgruppe leicht unter dem pH des gekoppelten Puffers hydrolysiert wird, so dass dieser SchrittIn wenigen Minuten fertig.

4.4 5-10 mg Antigen, gelöst in 5 ml gekoppelter Puffer, in das Gel hinzufügen

4,5 bei Raumtemperatur sanft mischen und schütteln für 2-4 Stunden oder 4 'C über Nacht, wenn eine geringe Menge der Lösung zu messen nach diesem Schritt zur Messung der Bindungswirksamkeit erforderlich ist. Waschen Sie das Medium einmal mit 20 ml gekoppelten Puffer.

4.6 Fügen Sie 15 mL 1% BSA-Lösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden oder 4 'C über Nacht inkubieren.

4.7 Waschen Sie das Medium mit Phosphatpuffer mehr als 3 Mal, jedes Mal mehr als 15 m h.

4.8 Die Festphase des Antigens ist abgeschlossen und kann zur Reinigung verwendet werden.

4.9 Wenn nicht sofort oder nach der Verwendung mit 20% Ethanol verschlossen werden.

5. Reinigung und Konservierung von Antiserum

5.1 Anti-Serum mit PBS und anderen Volumen verdünnen, 5000-10000 / min Zentrifugieren für 15 Minuten, nehmen Sie das Serum auf.

5.2 Reinigen Sie die Antigen-Affinitätssäule mit 10-fachem Volumen PBS, um die Säule auszugleichen.

5.3 10m verdünntes Antiserum in eine ausgewogene Säule hinzufügen.

5.4 bei Raumtemperatur sanft mischen und schütteln für 2-4 Stunden oder 4 'C über Nacht

5.5 Reinigen Sie die Antigensäule mit 10-fachem Volumen PBS, um die an die Säule gebundenen Heteroproteine zu waschen

5.6 Wäschen Sie die Säulen mit einem 2-fachen Volumen Antikörper-Abwasser, um spezifische Antikörper zu erhalten

5.7 Gleichgewichtssäule mit 10x Volumen PBS

5.8 Die Säulen mit 20% Alkohol versiegeln und bei 4'C aufbewahren.

Nach dem Entfernen des Antikörpers, nach der Konzentration von Saccharose oder Polyethyldiol in PBS dialysiert Salz, mit UV-sichtbarem Spektrophotometer in Wellenlänge 280 nm Antikörper OD-Wert zu bestimmen, der erhaltene OD-Wert geteilt durch 1,35 ist die gemessene Antikörper-Konzentration, 40-50% Glycerin in 20 ^ C hinzufügen kann langfristig erhalten werden.

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