Modellbasiertes Bio Human Colonoid Organ Culture Medium Kit Plus (vergrößert)

Human Colonic Organoid Kit Plus（Erweiterung）

Human Colonoid Organ Kulturmedium KitMehr(erweitert)

1、 Produktbeschreibung

Modellbasiertes Bio Human Colonoid Organ Kulturmedium KitMehr(erweitert)Human Colonic Organoid Kit Plus (Erweiterung) MehrEs ist ein Medium zur Vergrößerung des menschlichen Darm-Organs, das beim Vergrößern des menschlichen Darms hauptsächlich aus den Stammzellen des Dickdarms und den Stammzellen des Dickdarms besteht. Die Kolonoiden reproduzieren die Eigenschaften des in vitro Darm-Epithels in Bezug auf die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung, Gewebestruktur, Zelltypen und Funktion und sind daher ein ideales in vitro-Modell für die menschliche Darmstudie.

2、 Produktinformation

3、 Andere eigene Reagenzien und Verbrauchsmaterialien

4、 Anwendungsanweisung für menschliche Kolonioide Medium (Amplifikation)

1、 Nach Erhalt des Organoiden wird das Medium in4Der Kühlschrank wird aufgefroren.

2、 Nachdem das Medium aufgefroren ist, wird es vollständig umgekehrt und nach dem täglichen Bedarf in einem Biosicherheitsschrank oder einem sauberen Arbeitstisch aufgeteilt. Es wird empfohlen, es in10 ml/Rohr.

3、 Das aufgeteilte Medium ist bitte verschlossen und gelagert in-20℃Bei der Verwendung kann das aufgeteilte Medium nach der Platzierung der Raumtemperatur ausgeglichen verwendet werden.

5、 Aufbau und Fortpflanzung der menschlichen Kolonoiden

Hinweis: Studien, die ursprüngliches menschliches Gewebematerial umfassen, müssen alle einschlägigen Behörden und Regierungsvorschriften einhalten. Bevor das wichtigste menschliche Gewebematerial gesammelt wird, muss die informierte Zustimmung aller Probanden eingeholt werden.

a) Erstellung der ursprünglichen menschlichen Darm-Organe

1、 Die ursprüngliche Gewebeprobe sollte getrennt werden.5 MinutenGefüllt mit vorgekühlter lebender Gewebekonservation (2-8℃In einem Probenrohr muss die Probe mit einem Live-Gewebe-Konservat bedeckt werden (ersetzen Sie die gesamte Lösung mit einem vorgekühlten Live-Gewebe-Konservat, wenn die Probe bereits in einem anderen Puffer oder Medium gelegt wurde). niedrige Temperatur)2~8℃Transport zum Labor.

2、 Vor dem Experiment das Material auflegen4℃Auf dem Eis auftauen, während das Medium entfernt wird, um Raumtemperatur-Gleichgewicht zu platzieren. Zentrifugerrohre, Prüfrohre oder Kunststoff-Saugköpfe, die mit Zellen in Kontakt stehen, müssen nach dem Waschen mit einer organoiden Kultur-Anti-Adhesion-Schmiermittel verwendet werden.

3、 Am sauberen Arbeitstisch wird die Probe in eine Petrischale übertragen, um zu beurteilen, ob das gewonnene Gewebe aus der Epithelie besteht. Wenn Fett oder Muskelgewebe vorhanden ist, entfernen Sie diese nicht-epithelialen Bestandteile so viel wie möglich mit einem Messer oder einer Pinzette unter einem anatomischen Mikroskop. Wenn es kein Fett oder Muskelgewebe gibt, gehen Sie sofort zum nächsten Schritt.

4、 Übertragen der Gewebeprobe auf eine Dual-Anti-VorkühlungDPBSIn der Petri-Schale, mit dem Gesicht des Darms nach oben, die eine Hand verwendet, um das Darmgewebe am einen Ende festzuhalten, die andere Hand verwendet, um den Schleim oder den restlichen Stuhl auf der Oberfläche des Darms leicht zu kratzen, und dann das Darmgewebe in eine neue Doppelschicht platziertDPBSPetri-Schalen reinigen2-3Zweimal. Zerbrechen Sie den Darm nach der Reinigung auf ca.2mm * 5mmGröße, dann zu übertragen50 mlStarke Erschütterung im Zentrifugerrohr30s(Vertikaler Schock nach oben und unten20Zum nächsten Mal zählen, etwa1sDreimal.)Entfernen, wiederholen3Zweimal.

5、 Verdauung: Beitritt30 mlderDPBSZur Lösung hinzufügen300 μL 0,5 M EDTAbisEDTADie Endkonzentration ist5 mmSetzen.4℃auf dem Bett schütteln,80rpmVerdauung20 bis 30 Minuten(Abhängig von der Probengröße kann man20Blasen Sie die Verdauung unter dem Spiegel nach einer Minute und beobachten Sie den nächsten Schritt, wenn eine vollständige Zellstruktur beobachtet wird).

6、 Reinigung: Nachdem die Verdauung abgeschlossen ist, lassen Sie den Darm absetzen und löschen. Vorkühlung hinzufügenDPBSSanft schütteln, nach Ruhe wegwerfen, wiederholen2Zum EntfernenEDTA。

7、 Wiederholung: Beitritt30 mlVorgekühlt enthalten0,1 % BSAderDPBSDer Wirbel.10sNimm es rein.100 μmFilterfilterung, Sammlung von Gewebesuspension durch das Filter, wiederholte Sammlung2Zweimal.

8、 Sammlung:300gZentrifugalkraft4℃Zentrifugieren3 Minuten。

9、 Absorbieren Sie das Oberserum und suspendieren Sie die Fällung wieder in dem epitelialen Basismedium und nehmen Sie die Suspension zur latenten Zählung.

10、 300gZentrifugalkraft4℃Zentrifugieren3 MinutenAbsorbieren Sie die Oberflüssigkeit und fügen Sie die entsprechende Menge an Zellfällung nach den Kulturbedürfnissen zu dem Matrix-Gel hinzu (>70%und auf Eis mischen (Hinweis: die Bewegung des Mischens ist sanft zu bläsen, es ist nicht möglich, eine große Menge an Blasen zu erzeugen, die Mischung bei normaler Temperatur muss unter Kontrolle gestellt werden)15Innerhalb einer Sekunde) vermischt und auf Eis gelegt. Hinweis: Der Matrix-Kleber sollte auf Eis aufbewahrt werden, um zu verhindern, dass er sich verfestigt. den Prozess so schnell wie möglich durchführen. etwa50Ein Geheimnis sollte geimpft werden.25 μLIn der Substration. Nicht zu verdünnen der Matrix-Kleber (die Matrix-Kleber-Verhältnis sollte>70%(Volumen der Substrate)/Gesamtvolumen)), da dies die richtige Bildung von festen Tropfen hemmen kann.

11、 Stellen Sie die Mischung von Matrix-Glum und Zellen in die positive Unterseite der Kultivplatte und verwenden Sie den Pistolenkopf, um die Suspension leicht auszugleichen, um zu vermeiden, dass die Suspension die Seitenwände der Platte berührt. (Empfohlen:96Bohrplatte Impfung3 bis 10μL/Löcher,48Bohrplatte Impfung10 bis 20 μL/Löcher,24Bohrplatte Impfung20 bis 30 μL/Löcher).

12、 Hinweis: Sobald die Organoide wieder in der Matrix-Kleber suspendiert sind, so schnell wie möglich die Platte zu pflanzen, da die Matrix-Kleber in der Probe oder Pipette Saugkopf kondensieren kann.

13、 Kulturplatte in37℃und5 % CO₂In der Ausbildungsbox15-25Minute, lassen Sie die Substrat-Gele koagulieren.

14、 Nach der Kondensation des Matrix-Gels fügen Sie langsam ein organoides Medium entlang der Wand hinzu, das bei Raumtemperatur ausgewogen ist, um zu vermeiden, dass die Kondensationsstruktur beschädigt wird. (Empfohlen:96Bohrplatte hinzugefügt100 μL/Löcher,48Bohrplatte hinzugefügt250 μL/Löcher,24Bohrplatte hinzugefügt500 μL/Löcher). Hinweis: Fügen Sie das Medium nicht direkt an die Spitze des Matrix-Gluetröpfens hinzu, da dies die gefestigte Struktur zerstören kann.

15、 Die Kultivplatte in37℃und5 % CO₂in einem thermostatischen Aufbaukasten.

16、 Jedes Mal2~3Wechseln Sie das Medium einmal am Tag, saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem Loch und fügen Sie ein frisches, bei Raumtemperatur ausgewogenes organoides Medium hinzu.

17、 Der Wachstumszustand der Organoide wird genau überwacht.

b) Übertragungskultur menschlicher Darm-Organe

1、 Organkultur bis zum Durchmesser von600 μmWenn die Größe (oder wenn die Schwarzung nicht mehr erhöht wird) kann die Übertragung von Organoiden durchgeführt werden (pro Generation ca.1Woche). Folgende Verbrauchsmaterialien, die in Kontakt mit den Zellen stehen, müssen mit Schmiermitteln gespült werden:

2、 Absorbieren Sie das alte Medium, fügen Sie ein anderes Volumen-Epitelial-Basis-Medium hinzu, kraben Sie (oder blasen) Matrix-Kleber und Organoide mit einem Zellkraber oder Pipette-Saugkopf und übertragen Sie1,5 mlZentrifugerrohr (maximale Sammlung pro Rohr)2~3Lochorgane, um zu vermeiden, dass das Volumen zu groß ist, die Verdauungseffizienz ist niedrig), Blasen5~10Zweitens trennen Sie die Organoide und die Matrix,300gZentrifugieren3Minuten.

3、 Entfernen Sie die Flüssigkeit hinzugefügt5Verdauungsflüssigkeit, verdoppelt als das Volumen des Matrix-Klebstoffs und der organoiden Mischung, nach dem Blasen und Mischen in37℃Verdauung im Ausbaukasten3Minuten. Entfernen und mischen, nehmen10μLGemischte Flüssigkeitsspektur zur Verdauung300 μmLinks und rechts Organgruppen.

Hinweis: Ein Schritt zur Wiedersuspension der Abfälle muss die Kraft und die Anzahl der Schläge zu kontrollieren, ist die Größe der organoiden Klumpen zu kontrollieren300 μm左右。

4、 Nach Abschluss der Verdauung fügen Sie5Vielfach Volumen Epitelial-Basis-Medium sanft geblasen und gemischt, um die Verdauungsreaktion zu beenden und dann250gZentrifugieren3Minuten.

5、 Absorbieren Sie die Oberflüssigkeit und waschen Sie sie mit einem epithelialen Grundmedium2Zum Entfernen der restlichen Verdauungsflüssigkeit. Eine zweite Reinigung ermöglicht die Sammlung von Organoiden in derselben Zentrifugerrohr.

6、 Nach dem Abschluss der Reinigung werden die Zellen in der Zentrifugalfällung durch eine Transplantationskultur kultiviert und der Zellalfällung ein Matrix-Kleber hinzugefügt (>70%und auf Eis mischen (beachten Sie, dass die Bewegung des Mischens sanft ist, die Menge an Blasen zu erzeugen ist, die Mischung bei normaler Temperatur muss in15Innerhalb einer Sekunde) vermischt und auf Eis gelegt. Hinweis: Das Verhältnis der Verdünnung sollte70%Dies dient zur Gewährleistung der strukturellen Stabilität des Matrix-Klebstoffs während des Kultivierungsprozesses.

7、 Stellen Sie die Mischung von Matrix-Glum und Zellen in die positive Unterseite der Kultivplatte und verwenden Sie den Pistolenkopf, um die Suspension leicht auszugleichen, um zu vermeiden, dass die Suspension die Seitenwände der Platte berührt. (Empfohlen:96Bohrplatte Impfung3 bis 10μL/Löcher,48Bohrplatte Impfung10 bis 20 μL/Löcher,24Bohrplatte Impfung20 bis 30 μL/Löcher). etwa50Individuelle Organgruppen werden geimpft25 μLIn der Substration. Hinweis: Um eine Kondensation bei Raumtemperatur zu verhindern, sollte dieser Schritt so schnell wie möglich durchgeführt werden.

8、 Kulturplatte in37℃und5 % CO₂In der Ausbildungsbox15-25Minute, lassen Sie die Substrat-Gele koagulieren.

9、 Nach der Kondensation des Matrix-Gels fügen Sie langsam ein organoides Medium entlang der Wand hinzu, das bei Raumtemperatur ausgewogen ist, um zu vermeiden, dass die Kondensationsstruktur beschädigt wird. (Empfohlen:96Bohrplatte hinzugefügt100 μL/Löcher,48Bohrplatte hinzugefügt250 μL/Löcher,24Bohrplatte hinzugefügt500 μL/Löcher). Hinweis: Fügen Sie das Medium nicht direkt an die Spitze des Matrix-Gluetröpfens hinzu, da dies die gefestigte Struktur zerstören kann.

10、 Die Kultivplatte in37℃und5 % CO₂in einem thermostatischen Aufbaukasten.

11、 Jedes Mal2~3Wechseln Sie das Medium einmal am Tag, saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem Loch und fügen Sie ein frisches, bei Raumtemperatur ausgewogenes organoides Medium hinzu.

12、 Der Wachstumsstatus der Organoide wird genau überwacht, bis die Organoide den nächsten Experiment durchführen müssen.

V2.0Ausgabe

Aktualisierung:2025/6/12