Schnelles Klonen in einem Schritt

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Produktzusammensetzung:Schnelles Klonen in einem Schritt

Produktbeschreibung

Schnelles Klonen in einem Schritt

Die nahtlose Klontechnologie, die auf dem Rekombinationsprinzip basiert, ist als Klonmethode der neuen Generation nicht abhängig von mühsamen Enzymschnitt- und Verbindungsschritten und erfordert keine Endkomplementationsgleichheit, basierend auf der Rekombination von DNA-Fragmenten und linearen Trägerensenden mit 15 bis 25 nt-Homogenen-Sequenzen, kann das eingesetzte Fragment an beliebigen Stellen eines beliebigen linearen Trägers geklont werden, der Träger-Selbstverbindungshintergrund ist sehr niedrig, ist eine einfache, schnelle und effiziente DNA-orientierte Klontechnologie.

Schnelles Klonen in einem SchrittEin nahtloser Klon-Kit ermöglicht die Rekombination eines bis mehrerer DNA-Fragmente in einer Reaktion und dauert bis zu 5 Minuten mit einer positiven Rate von über 95%. Hilfsfaktoren, die im Kit hinzugefügt wurden, um die Klonpositivität effektiv zu erhöhen; Das optimierte Reaktionssystem kann Unreinheiten in unreinigten PCR-Produkten bis zu einem gewissen Grad tolerieren. Die Upgrade-Version des nahtlosen Klonkits bietet eine höhere Positivitätsrate und eine bessere Kompatibilität.

Experimentelle Schritte

1. Überblick über den experimentellen Prozess

2. Lineare Klonträgervorbereitung

Wählen Sie eine geeignete Klonstelle und linearisieren Sie den Träger, der durch Enzymschnitt oder Reverse PCR-Amplifikation durchgeführt werden kann.

① enzymatische Vorbereitung

Einige restriktive Endocytenzyme können die Hyperspiral-DNA nicht effektiv verdauen und können daher unterschiedliche Mengen an ungeschnittener Träger-DNA hinterlassen, was die positiven Raten verringert. Es wird empfohlen, das LightNingTM Rapid Intraceptase für eine Enzymschnitt (Mono- oder Bi-Enzymschnitt) zu verwenden, um den Träger zu linearisieren, um den Transformationshintergrund zu verringern (falsch positiver Klon durch ungeschnittene Träger-Transformation).

Anmerkung 1: Der Träger, der durch enzymatische Schnitte linearisiert wird, muss nicht dephosphorisiert werden, es wird empfohlen, einen bienzymatischen Schnitt zu verwenden.

Anmerkung 2: Nach Abschluss des Enzymschnitts wird empfohlen, das Enzym zu deaktivieren oder nach Reinigung des Zielprodukts für die Rekombinationsreaktion zu verwenden.

Reverse PCR Amplifikationsvorbereitung

Um die Einführung von Amplifikationsmutationen zu reduzieren, wird die Verwendung eines hochfidelitären PCR-Mix für Amplifikation empfohlen. Es wird empfohlen, prälineare Plasmide als Schablone zu verwenden, um die Auswirkungen von ringförmigen Plasmide-Schablonenrückständen auf die Klonpositivität zu verringern.

Hinweis 1: Wenn das PCR-Produkt keine nicht-spezifischen Streifen enthält, wird die Verwendung eines Template Eliminators (Artikelnummer EG21203) empfohlen, um eine Verdauungsplasmidschablone für die Rekombinationsreaktion zu verwenden. Es wird dagegen empfohlen, das PCR-Produkt nach Reinigung zu verwenden.

Hinweis 2: Bei der Multisegmentklonung wird empfohlen, das PCR-Produkt nach Reinigung zu verwenden.

3. Einfügen von Fragmenten PCR Primer Design

Das 5'-Ende des PCR-Primärs muss eine Sequenz von 15 bis 25 nt (empfohlen 18 nt) enthalten, die homogen ist mit dem Ende des benachbarten Fragments (Insertionsfragment oder Träger). Wenn der Träger ein klebriges Ende ist und das 3'-Ende vorstehend ist, muss die Vorrichtung einen vorstehenden Teil enthalten; Ist das 5'-Ende abstehend, kann der Einführungsdesign einen abstehenden Teil enthalten oder nicht.

Einfügen eines Front-Vergrößerungsprodukts:

5' Upstream-Carrier-End-Homogene-Sequenz + Enzym-Schnitt (optional) + Genspezifische positive Amplifikationssequenz 3'

Einfügen eines Umkehrvergrößerungsprodukts:

3' Genspezifische Reverse Amplification Sequenz + Enzym-Schnitt (optional) + Downstream Carrier End Homogene Sequenz 5'

Anmerkung 1: Wählen Sie möglichst eine Region ohne wiederkehrende Sequenzen und gleichmäßigen GC-Gehalt für das Klonen, wenn die Rekombination hoch ist, wenn der GC-Gehalt in der 25 nt-Region oben und unten der Trägerklonstelle 40% bis 60% beträgt;

Anmerkung 2: Die in diesem Kit angebotene Sequenz der pUC 19 Carrier (Ampr)-Anschlüsse ist wie folgt:

4. PCR-Amplifikation des eingesetzten Fragments

Es wird empfohlen, eine hochfidelitäre PCR-Mix zur Amplifikation zu verwenden, um die Einführung von Amplifikationsmutationen zu reduzieren. Es wird empfohlen, ein gereinigtes PCR-Produkt für eine nahtlose Klonreaktion zu verwenden, das direkt verwendet werden kann, wenn das PCR-Produkt durch Ioglidasegel-Elektrophorese als spezifisch amplifiziertes Produkt identifiziert wird, jedoch sollte das Probenvolumen nicht mehr als 20% des Gesamtreaktionsvolumens betragen.

5. Reorganisation Reaktion

Einrichten Sie im Eisbad folgende Reaktionssysteme:

a. Der optimale Trägerverbrauch (ng) = 0,02 × die Trägerbasis-Logarithmus, also 0,03 pmol.

b. Einfügen eines einzelnen Fragments mit der optimalen Fragmentmenge (ng) = 0,04 × Logarithmus der Fragmentbasis; Fügen Sie mehrere Segmente ein, die Zui-Menge pro Segment (ng) = 0,02 × Segment-Basen-Logarithmus.

Anmerkung 1: Ist das Einsetzen eines einzelnen Stücks größer als der Träger, so muss der Träger mit dem Einsetzen des Stücks ausgetauscht werden.

Anmerkung 2: Wenn die Länge des eingesetzten Fragments kleiner als 200 bps ist, sollte das 5-fache der Trägerverbrauch verwendet werden.

Anmerkung 3: Wenn die nach der oben genannten Formel berechnete MengeDer höchste Wert wird empfohlen, direkt zu drücken.ZuiMaximale Verwendung;

Hinweis 4: Bei zu langen Trägerfragmenten, zu langen Einsetzfragmenten oder zu vielen Fragmenten sinkt die Klonpositivität.

Nachdem die Herstellung des Reaktionssystems abgeschlossen ist, werden die Komponenten mit einer Pipette sanft angesaugt und vermischt, um Blasen zu vermeiden und niemals zu wirbeln.

Stellen Sie das Reaktionssystem auf 50 ° C und reagieren Sie 5 bis 60 min.

Anmerkung 1: Es wird empfohlen, ein präziseres Instrument wie ein PCR-Gerät zu verwenden, das eine geringe Reaktionszeit oder eine zu lange Kloneffizienz reduziert.

Hinweis 2: Beim Einfügen von 1 bis 2 Fragmenten beträgt die empfohlene Reaktionszeit 5 bis 15 Minuten; Wenn Sie 3 bis 5 Stücke einfügen, beträgt die empfohlene Reaktionszeit 15 bis 30 Minuten;

Hinweis 3: Wenn das Trägerskelett über 10 kb oder das Einsetzfragment über 4 kb ist, wird empfohlen, die Reaktionszeit auf 30 bis 60 min zu verlängern.

Anmerkung 4: Nach Abschluss der 50 ° C-Reaktion wird empfohlen, sofortige Zentrifuge durchzuführen, um die Reaktionsflüssigkeit auf den Rohrboden zu sammeln.

3. Die Reaktionsflüssigkeitszentrifuge wird auf Eis abgekühlt und dann umgewandelt oder bei -20 ° C gelagert.

Hinweis 1: -20 ° C Lagerung des Rekonstruktionsprodukts wird empfohlen, innerhalb von 1 Woche zu verwenden.

6. Umstellung von Restrukturierungsprodukten

Nehmen Sie 5 bis 10 μl Reaktionsflüssigkeit, fügen Sie zu 100 μl Gefühlszellen, langsam inhalieren und mischen, auf Eis 30 min. 42 ° C Hitze 45 ~ 60 sec, Eisbad 5 min. Zugabe von 500 µl SOC oder LB-Medium, Oszillationskultur bei 37 ° C 40 ~ 60 min (200 rpm). Die Flüssigkeit wird gleichmäßig auf eine Tablette mit dem entsprechenden Antibiotikum aufgetragen und umgekehrt bei 37 ° C über Nacht kultiviert.

Anmerkung 1: Die Endklonpositivitätsrate für verschiedene empfindliche Zellen kann variieren, empfohlen wird die Verwendung von empfindlichen Zellen mit einer Transformationseffizienz > 108 CFU / μg;

Anmerkung 2: Die Anzahl der Kolonien hängt von der Anzahl und Reinheit der PCR-Produkte und linearen Träger ab.

Hinweis 3: Positive Kontrolltabletten wachsen in der Regel eine große Anzahl weißer Monokolonien, während negative Kontrolltabletten nur sehr wenige Kolonien wachsen.

7. Positiver Klontest

Die Monokolonie wird in 10 µl ddH2O gemischt und nach 10 min 95 ° C-Klärung 1 µl Klärung als Vorlage genommen, um die PCR-Identifizierung der Kolonie durchzuführen, oder nach der Übernachtung der Monokolonie in einem resistenten Medium zu kultivieren, extrahieren Sie das Plasmid für die Enzymschnitt-Identifizierung.

Positive Kontrolle positiven Klonen nachgewiesen, Kolonien PCR-Vorläufer mit universellen Vorläufern M13F und M13R, Enzymatologie mit HindIII und EcoRI identifiziert.

Hinweis 1: Es wird empfohlen, bei der Kolonialpcr mindestens einen allgemeinen Vorläufer zu verwenden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden.

Hinweis 2: Die positiven Ergebnisse können bei Bedarf weiter sequenziert werden.

注3： M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R: CAGGAAACAGCTATGAC

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