Zusammenfassung

Das HPV-VP2-Protein ist als wichtiges strukturelles Antigen von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung neuer Impfstoffe. Die Forschung nutzte den Venetian Mini Pulser 399 Economy-Elektroperforator, um ein effizientes Expressionssystem aufzubauen, das die lösliche Expression von VP2-Proteinen durch die Optimierung der E. coli BL21 (DE3)-Transformationsbedingungen erreicht. Durch ELISA- und Western-Blot-Validierung bindet sich das Expressionsprodukt zu 89% der natürlichen Proteine an die spezifischen Antikörper des Mouth-and-Mouth-Virus-Virus und bietet technische Unterstützung für die Herstellung kostengünstiger Impfstoffrohstoffe.

Einleitung

Die Maul- und Klappkrankheit (FMD) ist eine intensive Infektionskrankheit, die die Tierhaltung gefährdet, und das strukturelle Protein VP2 des Krankheitserregers Maul- und Klappkrankheitsvirus (FMDV) ist an der Montage der viralen Hülle beteiligt und ist ein wichtiger Antigen-Epitopeträger, der die Herstellung neutralisierender Antikörper durch den Wirt induziert. Das Protokernel-Expressionssystem ist aufgrund seiner einfachen und kostengünstigen Bedienung eine Plattform für die Produktion von VP2-Antigenen in großem Maßstab. Allerdings ist das VP2-Protein reich an beta-Faltstrukturen, die sich leicht in E. coli zusammensetzen, und es gibt Probleme wie ineffiziente konventionelle Transformationsmethoden und schwere Zellschäden, die zu einer mangelnden Produktion von löslichen Proteinen und einer verletzlichen Antigenkonfiguration führen, was seine Anwendung in der Impfstoffentwicklung einschränkt.

Die Elektroperforationstechnik, die die Durchlässigkeit der Zellmembran durch ein pulsiertes elektrisches Feld sofort verändert, ist ein zentrales Mittel für die Auslieferung von exotischen Genen in Protonukleären Zellen. Der wirtschaftliche Elektroperforator Mini Pulser 399 von Venedig übertrifft die Grenzen herkömmlicher Geräte mit einer hochpräzisen Indexwellenpulstechnologie und einem Echtzeitbogenüberwachungssystem, um die Transformationseffizienz zu verbessern und gleichzeitig eine hohe Überlebensrate der Zellen zu gewährleisten. Die minimale Bedienungsoberfläche, die mit nur einem Klick auf die Spannungsparameter eingestellt werden kann, bietet eine innovative Lösung für die effiziente Expression und die Aufrechterhaltung der Antigenbeständigkeit des VP2-Proteins, indem sie in Kombination mit einem unabhängigen Transformationsdesign flexibel an eine Vielzahl von Probentypen wie Protonukleosen, Eukaryozen und Mikroorganismen angepasst wird.

1. Material und Methoden

1. Versuchsmaterial

Wirtsstamm: E. coli BL21 (DE3) (im Labor konserviert, genetischer Hintergrund durch 16S rRNA-Sequenzierung bestätigt) Zielgen: VP2-kodierende Sequenz des O-Stammes des Mouthquake-Virus (durch RT-PCR aus der Virus-RNA vergrößert, durch eine Sequenz eines Reagenzgestellten verifiziert) Expressionsträger: pET-32a (+) Plasmid (mit Ampicillinresistenzgen, im Labor konserviert) Reagenzien: LB-Medium (ein Reagenz, nach einer Standardformel hergestellt), Ampicillin (ein Reagenz, Endkonzentration 100 μg/ml), IPTG (ein Reagenz, induzierte Konzentration 0,5 M), Elektro-Transformationspuffer (10%ige Glycerinlösung, 0,22 μm Filter-Desterialisierung), Proteinreinigungs-Kit (eine Marke, mit Ni-NTA-Affinität-Layerharz), Polyklonale Antikörper spezifisch für das Mouthquake-Virus (im Labor selbst hergestellt, durch ELISA verifizierte Wirksamkeit ≥ 1:10.000)

2. Hauptinstrumente

Venetian Mini Pulser 399 Economy Elektroperforator (mit 0,1 cm Rotationsbecher für die Transformation von Protokernzellen, unabhängiger Rotationssitz für den schnellen Austausch von Experimentssystemen) Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge (Marke, Drehzahlgenauigkeit ±50 U/min, Temperaturregelbereich 4-40 °C) Thermostatisches Schüttelbett (Marke, Drehzahlbereich 20-300 U/min, Temperaturregelgenauigkeit ±0,1 °C) Fluoreszenz-Quantifizierungs-PCR (Marke, für den Nachweis der Rekombinationsplasmidkopienzahl) SDS-PAGE Elektrophoressystem (Marke, für die Herstellung von 8-16% Konzentrationsgradienten) Enzym-Calibrator (Marke, für den Nachweis von Wellenlängenbereichen 200-800 nm für ELISA-Analysen)

Erstellung des Protokernausdruckssystems

1. Rekonstruktion des Plasmidens

Die VP2-kodierende Sequenz wurde durch NdeI- und XhoI-Bisektion mit dem gleichen enzymatisch behandelten pET-32a (+)-Träger verbunden und in E. coli DH5α-empfindliche Zellen umgewandelt. Die Auswahl der Monokolonie in einem LB-Medium mit Ampicillin-Oszillationskultur von 37 ° C für 12 h, extrahieren Sie das Plasmid und durchführen Sie die Elektrophorese und Sequenzierungsprüfung des Aganasegels, um das korrekte rekombinierte Plasmid pET-32a-VP2 zu erhalten.

2. Empfindliche Zellvorbereitung

50 µL E. coli BL21 (DE3) aus einem Gefrierrohr bei -80 ° C in 5 ml LB-Medium und Oszillationskultur bei 37 ° C zu OD600 = 0,6. Bakterien Eisbad nach 30 min, 4 ° C, 5000 rpm Zentrifuge 10 min sammeln, waschen Sie die Bakterien 3 mal mit einem vorgekühlten Elektro-Rotationspuffer und schließlich wieder in 10% Glycerin-Lösung suspendiert, die Zellkonzentration auf 5 x 109 CFU / ml anpassen, in 50 μL / Röhre aufgeteilt, auf Eis aufbewahren oder nach dem Einfrieren von flüssigem Stickstoff - 80 ° C eingefroren.

3. Optimierung der Elektroperforationsumwandlung

Nehmen Sie 5 μL rekombiniertes Plasmid (Konzentration 1 μg / μL) und mischen Sie es mit 50 μL empfindliche Zellen und übertragen es in eine vorgekühlte 0,1 cm Elektro-Turnbecher. Wählen Sie auf dem Venetian Mini Pulser 399 Elektroperforator den 'Protokern-Modus', setzen Sie den Spannungsparameter auf 1,8 kV (nach dem Wert vor dem Experiment optimiert) und klicken Sie auf den Touchscreen-Knopf 'Start mit einem Klick', das Instrument erzeugt automatisch einen hochpräzisen Indexwellenpuls. Unmittelbar nach dem Ende des Impulses, 950 μL nicht-resistente LB-Medium hinzufügen, 37 ° C Oszillationserholung 1 h, nehmen Sie 100 μL LB-Tabletten mit Ampicillin beschichtet, zählen Sie die Kolonien nach 37 ° C-Kultur 12 h und berechnen Sie die Umwandlungsrate.

4. Induzierte Expression und Proteinreinigung

Auswahl der positiven Klone in 5 ml LB-Medium mit Ampicillin, Oszillationskultur bei 37 ° C bis OD600 = 0,8, im Verhältnis 1: 100 auf 500 ml Fermentationsmedium übertragen. Wenn OD600 1,2 erreicht, fügen Sie IPTG zur Induktion von 4 h, 4 ° C, 8000 rpm Zentrifugal sammeln Bakterien. Die Zellen wurden mit Ultraschall-Fragmentation (Leistung 300W, Arbeits 3s / Intervall 5s, insgesamt 30 Mal) und nach der Sammlung von Oberwasser (lösliches Protein) und Niederschlag (Inklusionskörper) mittels Zentrifugation geklatzt. Das Oberserum wurde durch Ni-NTA-Affinitätsschichtlyse gereinigt, mit 20-500 mM Imidazolgradienten gespült, die Zielproteinkomponenten gesammelt, die Reinheit der SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert und die Proteinkonzentration durch die Bradford-Methode bestimmt.

Methode der Antigenanalyse

Western Blot Prüfung

Das gereinigte VP2-Protein wird nach der SDS-PAGE-Isolierung in die PVDF-Membran übertragen, 5% entfettete Milchpulver 2 h geschlossen, 1 h Inkubation mit poliklonalen Antikörpern (1:5000 Verdünnung) zugefügt, 3 mal nach dem TBST-Waschen mit HRP-gekennzeichneter Schaf-Kaninchen-IgG-Binanz (1:10.000 Verdünnung) zugefügt, 1 h Inkubation mit ECL-chemiluminisierender Kit gefärbt und ein Gel-Bildgebungssystem erfasst.

Quantitative ELISA-Analyse

Das gereinigte Protein wird in einer 96-Loch-Platte verpackt, 2 h nach 4 ° C über Nacht mit 1% BSA geschlossen. Hinzufügen gradient verdünntes HPV-positives Serum (Anfangsverdünnung 1: 100), 37 ° C inkubieren 1 h, nach dem Waschen der Platte HRP-markierte Schaf-IgG-Antikörper (1: 5000 Verdünnung) hinzufügen, 30 min bei 37 ° C inkubieren, TMB nach der Darstellung der Farbe mit 2M H2 SO4 beenden, das Enzym-Calibrator erkennt den Absorptionswert von 450 nm. Berechnen Sie die relative Antigenaktivität mit natürlichem VP2-Protein als positiver Kontrolle (OD-Wert der experimentellen Gruppe / OD-Wert der positiven Kontrolle x 100%).

3. Vergleichliche Experimente

Setzen Sie zwei Kontrollgruppen ein: Gruppe A verwendet die herkömmliche chemische Umwandlungsmethode (CaCl₂-Methode), Gruppe B verwendet ein gewöhnliches Elektroperforator einer bestimmten Marke (feste Parameter: Spannung 2,0 kV/cm, einzelner Impuls), und die übrigen Kultivierungsbedingungen entsprechen den der Versuchsgruppe. Vergleich der Auswirkungen verschiedener Transformationsmethoden auf die rekombinierte Plasmid-Transformationsrate, VP2-Proteinlösliche Expression und Antigen.

IV. Ergebnisse und Diskussionen

1. Elektro-Piercing-Transformation-Effizienzanalyse

Der Mini Pulser 399 von Venedig verarbeitete eine Konversionsrate von 6,5 x 108 CFU/μg in der experimentellen Gruppe, was deutlich höher war als 8,0 x 105 CFU/μg in der Gruppe A und 3,2 x 108 CFU/μg in der Gruppe B. Fluoreszenz-quantitative PCR-Tests zeigten, dass die Anzahl der monobakteriellen Plasmodelkopien in der experimentellen Gruppe um 25% höher war als in der Gruppe B, was darauf hindeutet, dass die hochpräzise Indexwellenpulstechnologie die Effizienz der membranübergreifenden Lieferung von exotischer DNA effektiv verbessert hat. Das Echtzeit-Bogen-Überwachungssystem des Instruments kann die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von Funken unter 0,5% kontrollieren, um eine irreversible Schädigung der Pulsenergieschwankungen an der Zellmembran zu vermeiden und somit eine hohe Überlebensrate der empfindlichen Zellen aufrechtzuerhalten (Taipan-blaue Färbung zeigt eine Überlebensrate von ≥ 90%).

Proteinexpression und Löslichkeitsanalyse

Die Ergebnisse der SDS-PAGE-Elektrophoresis zeigten, dass die experimentelle Gruppe 4 h nach der Induktion eine klare Zielproteinstreife mit einem Molekulargewicht von etwa 42 kDa zeigte, die den theoretischen Werten entsprach. ImageJ-Software-Analysen zeigten, dass lösliche Proteine in der experimentellen Gruppe 58% der Gesamtexpression ausmachten, was deutlich höher war als 22% in der Gruppe A und 41% in der Gruppe B. Die Bradford-Methode ergab, dass die Versuchsgruppe 18,7 mg lösliches VP2-Protein pro Liter Kultur erhielt, was 52% höher war als 12,3 mg in der Gruppe B und fast neunmal höher war als 2,1 mg in der Gruppe A. Dies ist dank des zellfreundlichen Designs des Mini Pulser 399 möglich, dessen Pulsparameter automatisch durch einen integrierten Algorithmus auf die Eigenschaften der Protonukleären Zellmembrane abgestimmt werden, was die Fehlfaltung von Proteinen durch Zellstress reduziert und die Effizienz der löslichen Expression von der Quelle erhöht.

3. Bewertung der Antigenaktivität

Die Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die Reinigungsproteine in der experimentellen Gruppe eine spezifische Reaktion auf die Mouth-and-Mouth-Virus-Antikörper hatten und die Streifenstärke mit natürlichen Proteinen übereinstimmte, während die A- und B-Gruppen eine schwächere Streife aufgrund der Inklusionssomarmultiplikation verursachten. Quantitative ELISA-Analysen zeigten, dass das experimentelle Histoprotein eine Antigenaktivität von 89% erreichte, was signifikant höher war als 65% in der Gruppe B und 32% in der Gruppe A. Die runde Bichromatographie-Analyse zeigte, dass das beta-Faltgehalt des experimentellen Histoproteins bei 35% lag, nahe an 38% des natürlichen Proteins, was bewies, dass seine sekundäre strukturelle Integrität besser war als die Kontrollgruppe, was die schützende Wirkung des Venetian Electroporometers auf die Proteinkonfiguration bei einer geringen Verletzungskonversion weiter bestätigte.

V. Technische Vorteile der Ausrüstung und Synergie der experimentellen Parameter

Der Mini Pulser 399 von Venedig zeigt in dieser Studie drei Hauptvorteile:

Minimale Betriebsleistung: Es ist nicht erforderlich, komplexe Parameter abzuschalten, nur die Spannung einzustellen, um zu starten, und der Einstieg von Anfängern braucht 40% weniger Zeit als herkömmliche Elektroperforatoren, um die Experimentaleffizienz erheblich zu verbessern, insbesondere für die Multi-Charge-Konvertierungssicherung.

Präziser Impulsschutz: Hochpräzise Indexwellenpulse in Kombination mit Echtzeitbogenüberwachung, die eine effiziente Transformation gewährleisten und gleichzeitig die Zelltortalität unter 10% kontrollieren und eine stabile Wirtsumgebung für die Expression löslicher Proteine bieten.

Vielfältige Szenarienanpassung: Die unabhängige Elektrodrehsitzkonstruktion unterstützt die schnelle Umschaltung von Elektrodrehbechseln in verschiedenen Spezifikationen wie 0,1 cm und 0,2 cm, die sowohl kleine Proben auf Mikrogrammgröße verarbeiten als auch die Kompatibilität mit den Anforderungen der hohen Durchsatzumwandlung ermöglichen, um die gesamten Prozessanwendungen des Labors von der Grundforschung bis zur Prozessoptimierung zu erfüllen.

Im Experiment wurde festgestellt, dass die Zellkonzentration und die Spannungsparameter streng in Einklang stehen müssen: Wenn die Zellkonzentration höher als 8 x 109 CFU / ml ist, muss die Spannung auf 1,6 kV fein eingestellt werden, um eine übermäßige lokale elektrische Feldstärke zu vermeiden. Wenn die Glycerin-Konzentration in einem elektrischen Rotationspuffer um ± 2% schwankt, kalibriert die intelligente Kompensationsfunktion des Instruments die Impulsenergie automatisch, um eine stabile Umwandlungseffizienz zu gewährleisten (RSD ≤ 3% zwischen den Chargen). Diese Details spiegeln die präzise Steuerung des Geräts unter komplexen Versuchsbedingungen wider und bieten eine zuverlässige Garantie für die technische Wiederholbarkeit.

6. Anwendungsaussichten

Industrielle Produktion von Tierimpfstoffen

Das von der Forschung entwickelte VP2-Protein-Nucleus-Expressionssystem kann direkt auf die skalierbare Produktion von Mundkopf-Sub-Einheit-Impfstoffen angewendet werden. Die wirtschaftliche Positionierung und die effiziente Leistung des Mini Pulsers 399 von Venedig reduzieren die Konvertierungskosten für einzelne Chargen um mehr als 30 % und bieten in Kombination mit einem Fermentationsprozess mit hoher Dichte die Möglichkeit, die Produktionskosten pro Gramm rekombinantes Protein auf das Hälfte zu reduzieren als bei herkömmlichen Methoden. Die Parameter-Rückverfolgbarkeit und die Stabilität der Geräte, die den GMP-Standards entsprechen, unterstützen das Qualitätskontrollsystem der Impfstoffhersteller entscheidend.

2. Multipathogene Antigen-Hochdurchfluss-Screening

Die strukturelle Proteinexpression vieler Tier- und Vogelviren wie Schweinepest ermöglicht das modulare Design des Mini Pulser 399 den schnellen Wechsel von Wirtsstämmen (z. B. E. coli und Salmonella) in Kombination mit einem 96-Loch-Plate-Transformationsattachment (optional), um die parallele Expression von mehreren Antigenen und das erste Screening gegen Antigene zu erreichen, was den herkömmlichen Einzelprobenzyklus von 72 auf 48 Stunden verkürzt und den Forschungs- und Entwicklungsprozess eines neuen Impfstoffs erheblich beschleunigt.

3. Synthetische Biologie und Entwicklung von Diagnosereagenzien

Bei der Lieferung von Gen-Editing-Werkzeugen (wie der Import von Ingenieurbakterien durch das CRISPR-Cas9-System) und bei der Herstellung von Rohstoffen für Diagnostik-Kits können die niedrigen Schädigungstransformationseigenschaften des Geräts die lösliche Expression komplexer Proteine verbessern, insbesondere bei Antigenen, die reich an Dischwefelbindungen oder Glykosylierungsstellen sind. Beispielsweise kann die hohe Aktivität der Expression des VP2-Proteins in einem Mouth-and-Mouth-Virus-Typing-Diagnostik-Reagenz eine 15% höhere ELISA-Detektionsempfindlichkeit ermöglichen, was Tiermedizinischen Laboren auf der Grundlage präzisere Testinstrumente bietet.

Mit seiner hohen Transformationsfähigkeit, seinen zellfreundlichen Eigenschaften und seiner flexiblen Anpassungsfähigkeit ist der Mini Pulser 399 von Venedig das ideale Werkzeug zur Optimierung des Protokernexpressionssystems. Die Ausrüstung bietet 7 × 24 Stunden technischen Support und kostenlosen Stammparameteroptimierungsdienst, hat Dutzende von inländischen Veterinärpharmazeutischen Unternehmen und Hochschullaboren überprüft, um Wissenschaftlern effektiv zu helfen, die Flaschenhalse der rekombinanten Proteinexpression zu durchbrechen und die technologische Aktualisierung der Veterinärimpfstoff- und Diagnosereagensindustrie zu fördern.

Referenzen

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