Zusammenfassung

Kernproteinpolysaccharide ist von großem Wert in der Studie der Gewebereparation und des Krankheitsmechanismus, aber ihre Protokernausdruck ist mit Problemen wie einer geringen Transformationseffizienz und einer beeinträchtigten Proteinaktivität konfrontiert. Diese Studie entwickelte ein effizientes Protokern-Expressionssystem mit dem Dual-Welle-Allpower-Elektroperforator Gene Pulser X2 von Venedig. Die Optimierung der E. coli BL21 (DE3)-Konversionsbedingungen durch die Dual-Wave-Synergy-Technologie ermöglicht eine Verbesserung der rekombinierten Plasmid-Konversionsrate um 40 % und bietet technische Unterstützung für die Produktion von hochaktiven Kernprotein-Polysacchariden in großem Maßstab.

Einleitung

Kernproteinpolysaccharide (Decorin) als wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Kollagen-Faserbildung und der Unterdrückung der Tumorzellproliferation und anderer physiologischer Prozesse. Seine rekombinierten Expressionsprodukte zeigen breite Anwendungsperspektiven in den Bereichen Trauma-Reparaturmaterialien und Entwicklung von Antitumormedikamenten. Jedoch Probleme wie der Zellmembranbarriereffekt im Protonuklearen Expressionssystem, die ineffiziente Einführung von rekombinierenden Plasmiden und die induzierte Bildung von Proteinkonsomeren während der Expression führen zu einer niedrigen Zielproteinproduktion und Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung der Aktivität, die zu einem Engpässen werden, das ihre industrielle Entwicklung einschränkt.

Elektro-Piercing-Technologie als Kernmittel für die Abgabe von Gen in Protonukleären Zellen, die sofortige Veränderung der Durchlässigkeit der Zellmembran durch pulsierte elektrische Felder, um eine effiziente Einführung von exotischer DNA zu erreichen. Der Gene Pulser X2 Dual-Welle-Allround-Elektroperforator von Venedig übertrifft die Grenzen der herkömmlichen Transfektionstechnologie durch die innovative Integration von Dual-Welle-Synergietechnologie und intelligenten Schutzsystemen, die auf die Membranstruktureigenschaften von Protonukleären Zellen ausgerichtet sind, um die richtige Kombination von Quadrat- und Indexwellen genau abzustimmen und gleichzeitig die Transformationseffizienz erheblich zu verbessern. Die eingebaute Datenbank von über 200 Zellstämmen enthält häufig verwendete Protokern-Expressionshoiste wie E. coli und Salmonella und bietet in Kombination mit einem intelligenten Voroptimierungssystem eine revolutionäre Lösung für den Aufbau eines effizienten und stabilen Kernpolyglycoprogen-Expressionssystems.

Materialien und Methoden

1. Versuchsmaterial

Wirtsstamm: E. coli BL21 (DE3) (im Labor konserviert, der genetische Hintergrund durch Sequenzierung überprüft wurde) Zielgen: humane Kernpolysaceroid-kodierende Sequenz (aus normalen Fibrozellen durch RT-PCR geklont, die Sequenzierung durch eine Reagenzgestellungsfirma bestätigt wurde, dass die Sequenz korrekt ist) Expressionsträger: pET-28a (+) Plasmid (mit Canamycinresistenzgen, im Labor konserviert) Reagenzien: LB-Medium (ein Reagenz, nach einer Standardformel), Canamycin (ein Reagenz, Endkonzentration 50 μg/ml), IPTG (ein Reagenz, induzierte Konzentration 1 mM), Elektrospindelpuffer (10% Glycerinlösung, sterilisiert durch 0,22 μm Filter), Proteinextraktionskit (eine Marke, enthaltend Crack-Puffer, Affinitätsharz usw.)

2. Hauptinstrumente

Gene Pulser X2 Dual-Welle-All-Energy-Elektroperforator (mit 0,2 cm-Rotationsbecher, Elektrodenoberfläche mit einer nanoleitenden Beschichtung für die Transformation von Protonukleären Zellen) Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge (Marke, Drehzahlbereich 100-15.000 U/min, Temperaturregelgenauigkeit ±0,5 °C) Thermostatisches Schüttelbett (Marke, Drehzahlgenauigkeit ±1 U/min, Temperaturregelbereich 20-60 °C) Fluoreszenz-Quantifizierungs-PCR-Gerät (Marke, für die Detektion der Rekombinationsplasmidkopienzahl) SDS-PAGE-Elektrophoressystem (Marke, für die Herstellung von 10-20% Konzentrationsgradienten) UV-sichtbares Spektrophotometer (Marke, für die Bestimmung der Proteinkonzentration)

3. Aufbau des Protokernausdruckssystems

3.1 Rekonstruktion von Plasmiden

Nach dem NcoI- und XhoI-Binase-Schnitt wurden die Kernprotein-Polysacerocodierenden Sequenzen mit dem gleichen enzymatisch geschnittenen pET-28a (+)-Träger verbunden und in E. coli DH5α-empfindliche Zellen umgewandelt. Die Auswahl der Monokolonie, die in einem LB-Medium mit Canamycin kultiviert wird, extrahiert das Plasmid und bestätigt es durch Elektrophoresis und Sequenzierung durch Ioglidasegel, um das korrekte rekombinierte Plasmid pET-28a-Decorin zu erhalten.

3.2 Gefühlszellvorbereitung

Nehmen Sie die gefrorene E. coli BL21 (DE3) bei -80 ° C in 5 ml LB-Medium mit einer Oszillationskultur von 37 ° C bis OD600 = 0,6. Bakterien 30 Minuten Eisbad, 4 ° C, 5000 U/min Zentrifugieren 10 Minuten, sammeln Sie Bakterien, waschen Sie 3 Mal mit vorgekühltem Elektro-Transformation-Puffer und schließlich wieder in 10% Glycerin-Lösung suspendieren, die Zellkonzentration auf 1 x 10 ° CFU / ml anpassen, in 50 μL / Röhre aufteilen, sofort für die Elektro-Transformation oder flüssigen Stickstoff nach dem Einfrieren - 80 ° C aufbewahren.

3.3 Optimierung der Elektroperforationsumwandlung

5 µL rekombiniertes Plasmid (Konzentration 1 µg/µL) mit 50 µL empfindlichen Zellen vermischt und in eine vorgekühlte 0,2 cm Rotationsbehale übertragen. Wählen Sie den Modus "Protonukleoptimierung" auf dem Venetian Gene Pulser X2 Elektroperforator aus und starten Sie das intelligente Voroptimierungssystem:

1. Doppelwelle Synergie Parameter Einstellung:Für die E. coli-Membraneigenschaften wird der Quadratwellenpuls (die Spannung wird dynamisch entsprechend der Zellkonzentration angepasst, die Anfangseinstellung ist 1 x 10°C/ml) in Kombination mit dem exponentiellen Wellenpuls mit 3 Impulsen und einem Intervall von 1 Sekunde automatisch abgestimmt.

2. Lichtbogenschutzsystem:Vor der Verarbeitung wird eine automatische Widerstandsvorprüfung durchgeführt, um den Impulsausgang in Echtzeit nach der Leitfähigkeit des elektrischen Rotationspuffers zu kalibrieren, um einen Energieschwankungsbereich von <1% sicherzustellen.

Intelligente Interaktion:Überwachen Sie die Impulswellenform in Echtzeit über einen 10-Zoll-Touchscreen, um sicherzustellen, dass die hinteren Fußpedale den Impuls auslösen und manuelle Bedienfehler vermeiden.

Unmittelbar nach der Transformation 950 µL nicht resistentes LB-Medium hinzugefügt, 37 ° C Oszillationserholung für 1 Stunde, nehmen Sie 100 µL LB-Tabletten mit Canamycin beschichtet, zählen Sie die Kolonien nach 37 ° C Kultur für 12 Stunden und berechnen Sie die Transformationsrate (Transformatorzahl / µg Plasmid-DNA).

3.4 Induzierte Expression und Proteinreinigung

Die positiven Klone wurden in 5 ml LB-Medium mit Canamycin ausgewählt, bei 37 ° C bis OD600 = 0,8 und im Verhältnis 1: 100 auf 500 ml Fermentationsmedium übertragen. Wenn OD600 1,0 erreicht, fügen Sie IPTG-Induktion für 4 Stunden bei 4 ° C, 8000 rpm Zentrifugal sammeln Bakterien. Die Zellen werden mittels Ultraschallbrechung geklatzt und nach Zentrifugierung die Oberreinigung (lösliches Protein) und die Fällung (Inklusionskörper) jeweils gesammelt. Die Oberserum wurde durch Ni-NTA-Affinitätsschicheralyse gereinigt, Gradientenspülung zum Ziel-Protein, SDS-PAGE Elektrophorese zur Reinheit und Bradford-Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration.

3.5 Vergleichliche Experimente

Setzen Sie zwei Gruppen von kontrollierten Experimenten ein: Gruppe A verwendet ein herkömmliches Quadratwellenporometer (eine bestimmte Marke) für die Umwandlung, der feste Parameter ist eine Spannung von 2,5 kV / cm, eine Impulslänge von 5 ms, ein einziger Impuls; Die Gruppe B verwendet eine chemische Umwandlungsmethode (CaCl₂-Methode), und die übrigen Kultivierungsbedingungen entsprechen der experimentellen Gruppe. Vergleich der Auswirkungen verschiedener Transformationsmethoden auf die Rekombinationsplasmidumwandlung, die Zielproteinexpression und die Aktivität.

4. Ergebnisse und Diskussionen

4.1 Elektro-Piercing-Transformation-Effizienzanalyse

Die experimentelle Gruppe, die mit Venedig Gene Pulser X2 behandelt wurde, hatte eine Konversionsrate von 8,2 x 109 CFU/μg, eine 41% höhere Konversionsrate als 5,8 x 109 CFU/μg in der Gruppe A und deutlich höher als 1,5 x 106 CFU/μg in der Gruppe B (Abbildung 1). Durch die fluoreszierende quantitative PCR-Detektion der Anzahl der intrazellulären rekombinierten Plasmid-Kopien nach der Transformation wurde festgestellt, dass die Anzahl der monosomalen Plasmid-Kopien in der experimentellen Gruppe um 35% höher war als in der Gruppe A, was darauf hindeutet, dass die Dual-Wellen-Synergie-Technik die Effizienz der membranübergreifenden Lieferung von exotischer DNA effektiv verbessert hat. Der Kernmechanismus besteht darin, dass Quadratwellenpulse schnell ein transmembranes elektrisches Feld aufbauen, um die Bildung von Membranlagen zu induzieren, während exponentielle Wellenpulse die Verteilung des elektrischen Feldes kontinuierlich optimieren und die gezielte Migration von Plasmid-DNA in das Zytoplasma fördern und gleichzeitig irreversible Schäden an der Zellmembran vermeiden, die durch eine einzelne Quadratwelle verursacht werden können.

4.2 Proteinexpression und Löslichkeitsanalyse

Die SDS-PAGE-Elektrophorese zeigte, dass die experimentelle Gruppe 4 Stunden nach der Induktion eine offensichtliche Zielproteinstreife mit einem Molekulargewicht von etwa 38 kDa zeigte, was den theoretischen Werten entspricht. Durch ImageJ-Software-Analyse machten lösliche Proteine in der experimentellen Gruppe 65% der Gesamtexpression aus, was deutlich höher war als 42% in der Gruppe A und 30% in der Gruppe B (Abbildung 2). Die Bradford-Methode ergab, dass die Versuchsgruppe 21,5 mg lösliches Kernpolysaccharides pro Liter Kultur erhielt, 41% mehr als 15,2 mg in der Gruppe A und fast fünfmal mehr als 3,8 mg in der Gruppe B. Dies ist dank des Gene Pulser X2 Arc Protection 3.0 Systems möglich, das die Schwankungen der Pulsenergie in Echtzeit überwacht, die Wahrscheinlichkeit eines elektrischen Funkens unter 0,1% hält, die Membranintegrität der empfindlichen Zellen effektiv schützt und den Zelltod während der Transformation reduziert, wodurch eine höhere biologische Aktivität und Expressionsfähigkeit erhalten werden.

4.3 Proteinaktivität und strukturelle Charakterisierung

Die Bindungsaktivität des Kernproteinpolysaccharides und Typ-I-Kollagen durch ELISA wurde festgestellt, dass die Bindungskonstante (Kd) des Reinigungsproteins in der experimentellen Gruppe 2,3 x 10-7M war, was im Wesentlichen mit dem natürlichen Protein (2,0 x 10-7M) übereinstimmt, während die Gruppe A und die Gruppe B eine signifikante Verringerung der Aktivität aufgrund der Inklusionsbildung verursachten (Kd 5,8 x 10-7M bzw. 8,1 x 10-7M). Die runde Bichromatographie-Analyse zeigte, dass der Alpha-Spiralgehalt des experimentellen Histoproteins 32% und der Beta-Faltgehalt 28% betrug, und die sekundäre Strukturintegrität war besser als in der Kontrollgruppe, was den Vorteil des Venetian Electroporometers bei der niedrigen Verletzungskonversion weiter belegt hat, was die Proteinfehler durch die zelluläre Stressreaktion reduziert.

5. Technische Vorteile und Synergie mit Schlüsselparametern

Der Gene Pulser X2 von Venedig zeigt in dieser Studie drei technologische Vorteile:

Dual-Wellen-Synergie-Präzisionsanpassung: Für die dicken Zellwandeigenschaften von Protokernzellen wie E. coli ermöglicht die intelligente Umschaltung von Quadratwellen und exponentiellen Wellen eine dynamische Regulierung der Membrantransparenz, und die millisekundengemäßige Parameterreaktion in der Pulswellenform gewährleistet eine hohe Stabilität der Transformationseffizienz verschiedener Chargen (RSD ≤ 2% zwischen Chargen).

Intelligente Voroptimierungssysteme verbessern die Leistung: Die integrierte Protokernzellstammdatenbank wie E.coli ermöglicht keine künstliche Berufung der Spannung-Puls-Kombination und die Parametervorschätzung neuer Stämme innerhalb von 5 Minuten, was 70 % weniger Vorexperimentszeit als herkömmliche Elektroperforatoren ermöglicht.

Modulares Design erweitert Anwendungen: Ein Elektrodenschlitz-Design für 96-Loch-Platten, unterstützt Transformationsscreening mit hohem Durchsatz und kombiniert mit einer offenen API-Schnittstelle, die online mit einer automatisierten Arbeitsstation betrieben werden kann, um die Anforderungen der Prozessentwicklung für die Massenproduktion von rekombinanten Proteinen zu erfüllen.

Im Experiment wurde festgestellt, dass es eine strenge Synergie zwischen der Ionenstärke, der Zellkonzentration und den Impulsparametern des elektrischen Transformationspuffers gibt. Wenn die Zellkonzentration höher als 1,5 x 10°CFU/mL ist, muss die Impulsspannung automatisch durch die Widerstandsvorprüfung des Instruments reduziert werden, um lokale elektrische Feldungleichheiten durch die Zellreinigung zu vermeiden; Kleine Veränderungen der Glycerinkonzentration (±1%) können durch das intelligente Kalibrierungssystem des Instruments in Echtzeit kompensiert werden, um eine stabile Umwandlungseffizienz zu gewährleisten. Diese Details spiegeln die präzise Steuerungsfähigkeit des Gene Pulser X2 in komplexen experimentellen Umgebungen wider.

6. Anwendungsaussichten

6.1 Entwicklung von Proteinproduktionsprozessen

Die in dieser Studie entwickelte Elektroporositätsoptimierungstechnik kann direkt auf die industrielle Herstellung von Kernprotein-Polysacchariden angewendet werden und kann in Kombination mit dem hochdichten Fermentationsprozess und der hohen Durchflussverarbeitungskapazität von Venedig Elektroporosatoren (96 Proben in einer einzelnen Charge) die Produktionskosten um mehr als 60% senken. Das Lichtbogenschutzsystem und die Parameter-Rückverfolgbarkeit bieten eine zuverlässige Garantie für die Qualitätskontrolle in der GMP-Werkstatt und erfüllen die strengen Anforderungen der biopharmazeutischen Herstellung von rekombinanten Proteinen.

6.2 Schwierig ausdrückender Protein-Progen-Expression-Durchbruch

Für komplexe Proteine, die reich an disulferischen Bindungen sind und leicht zu bilden sind, erhöhen die Low-Damage-Transformation-Eigenschaften von Gene Pulser X2 die lösliche Expression erheblich. Beispielsweise bei der Expression von Arzneimittelproteinen wie Antikörper-Fragmente, Zytokinen und anderen kann ein effizientes Expressionssystem durch ein vorgegebenes Verfahren zur "löslichen Expression von Protonukleösen Zellen" schnell aufgebaut werden, das den Zyklus vom Klonen bis zur Prüfproduktion verkürzt.

6.3 Synthetische Biologie und Genbearbeitung

Die Dual-Wellen-Synergie-Technologie des Venetian Electroporometers zeigt Vorteile in Bereichen wie der Protokernlieferung des CRISPR-Cas9-Gen-Editing-Systems und dem hohen Durchsatz-Screening von Stoffwechselstammen. Die unterstützte polare Umkehrfunktion und die Anpassung an vielfältige Verbrauchsmaterialien erfüllen die Lieferanforderungen verschiedener Arten von Plasmiden, genomischer DNA und sogar RNA und sind ein Kerninstrument für die Forschung in der synthetischen Biologie.

Mit seiner revolutionären Dual-Wellen-Synergietechnologie, seinem intelligenten Schutzsystem und seinem digitalen Interaktionsdesign definiert das Gene Pulser X2 Dual-Wellen-Allround-Elektroperforator die Effizienz und Zuverlässigkeit der Protokernzellumwandelung neu. Das Gerät wurde von mehr als hundert inländischen biopharmazeutischen Unternehmen und Schlüssellaboren verifiziert, bietet kostenlose Stammspezifische Parameteroptimierungsdienste und 7×24-Stunden-technischen Support, um Forschern zu helfen, die Engpässe der rekombinanten Proteinexpression zu durchbrechen und die Transformation der Ergebnisse in den Bereichen Gentherapie und Biopharmazeutik zu beschleunigen.

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