Zusammenfassung

Wild Sand Silk Kupfer-Zink-Superoxid-Discriminase (Cu / Zn-SOD) ist ein antioxidatives Schlüsselenzym, dessen effiziente Protokernausdruck von großer Bedeutung für die landwirtschaftliche Resistenzforschung und die biomedizinische Entwicklung ist. Die Forschung nutzte den Venetian Gene Pulser 830 Quadratwellenelektroporator, um ein effizientes Expressionssystem aufzubauen, das die lösliche Expression des Zielgenes durch die Optimierung der E. coli BL21 (DE3)-Transformationsbedingungen erreicht. Nach der Sequenzierung und Analyse der Enzymaktivität erreicht das Rekombinativprotein 92% der natürlichen Enzyme und bietet technische Unterstützung für die Verbesserung der Antiretrospektive und die Entwicklung von Antioxidantien.

Einleitung

Superoxid-Discriminase (SOD) ist die erste Verteidigungslinie für die Beseitigung freier Sauerstoffradikale im Organismus, wobei Kupfer-Zink-SOD (Cu / Zn-SOD) weit verbreitet ist und eine Schlüsselrolle bei physiologischen Prozessen wie oxidativer Stressreaktion, Alterungsregulierung und Widerstandsanpassung spielt. Bombyx mandarina (Bombyx mandarina) ist eine nahe verwandte Art von Hausseiden, deren Cu / Zn-SOD-Gen (benannt BmCu / Zn-SOD) möglicherweise einen antiretromolekularen Mechanismus enthält, der einen wichtigen Forschungswert für die Schadstoffbekämpfung und die Kultivierung von Hausseiden hat.

Das Protokern-Expressionssystem ist aufgrund seiner einfachen Bedienung und Kostenkontrolle eine Plattform für den Zugang zu rekombinanten SOD-Proteinen. Allerdings enthält das Cu/Zn-SOD-Protein aus Insekten eine konservative Disulfelbindungsstruktur, die in E. coli leicht Inklusionskörper bildet, und die traditionelle chemische Transformationsmethode hat niedrige Effizienz, schwere Zellschäden und andere Probleme, die zu einer mangelnden Produktion von löslichen Proteinen und einer beschädigten Enzymaktivität führen, die seine funktionelle Forschung und Anwendungsentwicklung einschränkt. Die Elektroperforationstechnik, die die Durchlässigkeit der Zellmembran durch ein pulsiertes elektrisches Feld sofort verändert, ist ein zentrales Mittel für die Auslieferung von exotischen Genen in Protonukleären Zellen. Der Gene Pulser 830 Quadratwellen-Elektroperforator von Venedig überwindet die Grenzen herkömmlicher Geräte mit einer hochintensiven Quadratwellenpulstechnologie und einem intelligenten Überwachungssystem mit voller Wellenform, das die Transformationseffizienz erheblich erhöht und gleichzeitig eine hohe Überlebensrate der Zellen gewährleistet. Sein vorprogrammiertes Optimierungssystem verfügt über eine integrierte Bibliothek mit mehreren Zellstammparametern, die sich mit einem Klick an die effiziente Transformation von Protonukleozellen wie E. coli anpassen können, was eine innovative Lösung für die lösliche Expression und die Aufrechterhaltung der Aktivität von Cu/Zn-SOD-Proteinen von Wildseiden bietet.

1. Material und Methoden

1. Versuchsmaterial

Wirtsstämme: E. coli DH5α (zum Klonen) und BL21 (DE3) (zur Expression), im Labor konserviert, genetischer Hintergrund durch 16S rRNA-Sequenzierung bestätigt. Ziel-Gen: Cu/Zn-SOD-Codierende Sequenz von Wild Sandwich (durch RT-PCR-Amplifikation aus der GesamtRNA von Wild Sandwich Puppen erhoben, wobei das Protor-Design die NcoI- und XhoI-Enzym-Schnittstellen einführt). Expressionsträger: pET-28a (+) Plasmid (enthält Canamycin-Resistenzgen, im Labor erhalten). Reagenzien: RNA-Extraktions-Kit (ein Reagenz), PrimeScript RT-PCR-Kit (ein Reagenz), Restriktive Intracetase NcoI und XhoI (ein Reagenz), T4 DNA-Connectase (ein Reagenz), LB-Medium (ein Reagenz, nach Standard-Rezeptur), Canamycin (ein Reagenz, Endkonzentration 50 μg/ml), IPTG (ein Reagenz, induzierte Konzentration 0,8 mM), Elektro-Rotationspuffer (10% Glycerinlösung, 0,22 μm Filter-Desterialisierung), Proteinreinigungs-Kit (eine Marke, enthaltend Ni-NTA-Affinitätsharz), SOD-Aktivitäts-Testkit (ein Reagenz, basierend auf der Yellowpurine-Oxidase-Methode).

2. Hauptinstrumente

Gene Pulser 830 Quadratwelle Elektroperforator von Venedig (mit 0,1 cm Rotationsbecher für die Transformation von Protonukleären Zellen, Unterstützung der Polarität und des Bogenschutzes); Hochgeschwindigkeits-Gefrierzentrifuge (bestimmte Marke, Drehzahlgenauigkeit ± 50 U/min, Temperaturregelbereich 4-40 ° C); Thermostatisches Schaukelbett (bestimmte Marke, Drehzahlbereich 20-300 U/min, Genauigkeit der Temperaturregelung ± 0,1 ° C); Fluoreszenz-quantitatives PCR-Gerät (eine Marke für den Nachweis der Rekombinationsplasmidkopienzahl); SDS-PAGE Elektrophoresiesystem (eine Marke, unterstützt die Herstellung von Klebstoffen mit einer Konzentration von 8-16%); Enzym-Calibrator (eine Marke, detektiert Wellenlängenbereich von 200-800 nm für die Detektion von SOD-Aktivität).

2. Genklonung und Vehicle-Konstruktion

1. GesamtRNA-Extraktion und cDNA-Synthese

Nehmen Sie 50 mg Gewebe von Wild-Sand-Puppen und extrahieren Sie die gesamte RNA mit einer RNA-Extraktions-Kit. Die RNA-Reinheit OD260/OD280 beträgt 1,98 und eine Konzentration von 500 ng/μL wird durch eine 1% Ionasegel-Elektrophorese und ein NanoDrop-Spektrophotometer untersucht. Abnahme von 2 μg RNA und Synthese der ersten Kette cDNA mit PrimeScript RT-PCR Kit, Reaktionssystem umfasst 5 x PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， Füllen Sie RNase-freies Wasser bis zu 20 µL bei 37 ° C für 15 min und 85 ° C für 5 s.

2. Ziel-Gen-Amplifikation und enzymatische Schnittverbindung

cDNA als Vorlage mit spezifischen Vorläufern (Upstream-Vorläufer: 5'-CCATGGATGCTGCTGCTGCTGCT-3') mit NcoI-Enzym-Schnittstellen; Downstream: 5'-CTCGAGTCACTTGGTGGCGTCGTC-3', mit XhoI-Enzym-Schnittstellen) für PCR-Amplifikation. Das Reaktionssystem ist 2 x Taq PCR Master Mix 25 µL, 1 µL für jeden oberen und unteren Wanderer, 2 µL für die cDNA-Schablone und die Zusatzung von ddH₂O bis 50 µL. Verstärkungsbedingungen: 95 ° C prävariabel 5min; 95 ℃ Verformung 30s, 58 ℃ Hitzen 30s, 72 ℃ Verlängerung 1min, 35 Zyklen; 72 ° C 10 min verlängern. Das PCR-Produkt wurde durch Elektrophorese von 1,5% Ionase Gel isoliert, schneidet Gel-Recycling-Fragmente (ca. 600 bp), mit pET-28a (+) Träger durch NcoI bzw. XhoI Bienzym geschnitten und über Nacht mit T4 DNA-Konnektase 16 ° C verbunden, um rekombinierende Plasmide pET-28a-BmCu / Zn-SOD zu bauen.

Optimierung des Protokern-Expressionssystems

1. Empfindliche Zellvorbereitung

50 µL E. coli BL21 (DE3) aus einem Gefrierrohr bei -80 ° C in 5 ml LB-Medium und Oszillationskultur bei 37 ° C zu OD600 = 0,6. Bakterien Eisbad nach 30 min, 4 ° C, 5000 rpm Zentrifuge 10 min sammeln, waschen Sie die Bakterien 3 mal mit einem vorgekühlten Elektro-Rotationspuffer und schließlich wieder in 10% Glycerin-Lösung suspendiert, die Zellkonzentration auf 5 x 109 CFU / ml anpassen, in 50 μL / Röhre aufgeteilt, auf Eis aufbewahren oder nach dem Einfrieren von flüssigem Stickstoff - 80 ° C eingefroren.

2. Elektro-Piercing-Umwandlung

Nehmen Sie 5 μL rekombiniertes Plasmid (Konzentration 1 μg / μL) und mischen Sie es mit 50 μL empfindliche Zellen und übertragen es in eine vorgekühlte 0,1 cm Elektro-Turnbecher. Wählen Sie auf dem Venetian Gene Pulser 830 Elektroperforator den „Protonukleus-Modus“, aktivieren Sie das vorprogrammierte Optimierungssystem, rufen Sie mit einem Klick die empfohlenen E. coli BL21 (DE3)-Parameter (Quadratwellenpuls, Spannung 1,8 kV, 1-mal) auf und klicken Sie auf den Touchscreen, um das Programm zu starten. Das Instrument zeigt die Dynamik der Wellenform und der Parameter des Impulses in Echtzeit an und erzeugt nach dem Ende des Impulses automatisch experimentelle Aufzeichnungen. Anschließend sofort 950 μL resistente LB-Medium hinzufügen, 37 ° C Oszillationserholung für 1 h, nehmen Sie 100 μL LB-Tabletten mit Canamycin beschichtet, zählen Sie die Kolonien nach 37 ° C Kultur für 12 h und berechnen Sie die Umwandlungsrate.

3. Induzierte Expression und Proteinreinigung

Auswahl der positiven Klone in 5 ml LB-Medium mit Canamycin, Oszillierung bei 37 ° C bis OD600 = 0,8, im Verhältnis 1: 100 auf 500 ml Fermentationsmedium übertragen. Wenn OD600 1,2 erreicht, fügen Sie IPTG zur Induktion von 4 h, 4 ° C, 8000 rpm Zentrifugal sammeln Bakterien. Die Zellen wurden mit Ultraschall-Fragmentation (Leistung 300W, Arbeits 3s / Intervall 5s, insgesamt 30 Mal) und nach der Sammlung von Oberwasser (lösliches Protein) und Niederschlag (Inklusionskörper) mittels Zentrifugation geklatzt. Das Oberserum wurde durch Ni-NTA-Affinitätsschichtlyse gereinigt, mit 20-500 mM Imidazolgradienten gespült, die Zielproteinkomponenten gesammelt, die Reinheit der SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert und die Proteinkonzentration durch die Bradford-Methode bestimmt.

IV. Identifikations- und Aktivitätsanalysemethoden

1. Gensequenzierung

Extrahieren Sie das rekombinierte Plasmid pET-28a-BmCu/Zn-SOD, beauftragen Sie ein Sequenzierungsunternehmen mit der bidirektionalen Sequenzierung und vergleichen Sie die Sequenzierungsergebnisse mit dem GenBank-Gen Cu/Zn-SOD (Registrierungsnummer XXX) mit der DNAMAN-Software, um die ORF-Korrektheit und die Basismutationen zu überprüfen.

SDS-PAGE und Western Blot Analyse

Das gereinigte recombinante Protein wird durch eine SDS-PAGE Elektrophorese (12% Isolator) durchgeführt und die Proteinbänder mit einem Molekulargewicht von ca. 22 kDa (mit His-Etikett) nach einer leuchtenden blauen Färbung durch Kaumach beobachtet. Zur gleichen Zeit wird die PVDF-Membran, 5% entfettete Milchpulver geschlossen 2 h, fügen Sie Ratten Anti-His-Etikett monoklonalen Antikörper (1: 5000 Verdünnung) zu inkubieren 1 h, TBST-Film 3 mal nach HRP-markierte Schaf-Ratten IgG-II-Antibiotik (1: 10.000 Verdünnung) hinzugefügt, 1 h nach Inkubierung mit ECL-chemiluminierende Kit, Gel-Imaging-System, um Bilder zu erfassen.

SOD-Enzymaktivität

Verwenden Sie die Yellowpurine-Oxidase-Methode und befolgen Sie die SOD-Aktivitätstest-Kit-Anleitung. Das gereinigte Protein wird auf eine geeignete Konzentration verdünnt und dem Reaktionssystem (enthaltend Yellowpurine, Yellowpurine Oxidase und Nitrogen-Tetrazol) hinzugefügt. Nach 5 min 25 ° C-Reaktion wird der 560 nm Absorptionswert mit dem Enzym-Scaler erkannt. Die erforderliche Enzyme zur Hemmung der Nitrogen-Tetrazol-Reduktion um 50% in einer Vitalitätseinheit (U), berechnen Sie die Rekombination-Protein-Verhältnis-Vitalität (U / mg) und vergleichen Sie es mit natürlichen Cu / Zn-SOD aus Wild Sand Silk (aus der Silkenpuppe extrahiert und mit einem bestimmten Reagenz gereinigt).

4. Vergleichliche Experimente

Setzen Sie zwei Kontrollgruppen ein: Gruppe A verwendet die herkömmliche chemische Umwandlungsmethode (CaCl₂-Methode), Gruppe B verwendet ein gewöhnliches Elektroperforator einer bestimmten Marke (feste Parameter: Spannung 2,0 kV, einzelner Impuls), und die übrigen Kultivierungsbedingungen entsprechen der experimentellen Gruppe. Vergleich der Auswirkungen verschiedener Transformationsmethoden auf die Rekombinationsplasmidumwandlungsrate, die BmCu/Zn-SOD-Proteinlösliche Expression und die Enzymaktivität.

V. Ergebnisse und Diskussionen

1. Genklonung und Sequenzanalyse

RT-PCR hat den Zielfragment um etwa 600 bp erfolgreich vergrößert, was der erwarteten Größe entspricht. Die Sequenzierungsergebnisse zeigten, dass das klonierte BmCu/Zn-SOD-Gen ORF mit einer Gesamtlänge von 585 bp kodierte 194 Aminosäuren, 99,8% Homogenität mit der GenBank-Login-Sequenz und nur eine synonyme Mutation (T → C) am 356. Bit auftrat, ohne die Aminosäuresequenz zu ändern. Die rekombinierende Plasmid pET-28a-BmCu/Zn-SOD wurde durch eine bienzymatische Trennung identifiziert und die Elektrophoresis der Trennungsprodukte zeigte eine Trägerstreife von etwa 5369 bp und eine Zielstreife von 585 bp, was beweist, dass das Zielgen korrekt in den Träger eingesetzt wurde.

2. Verbesserte Effizienz der Elektroperforationsumwandlung

Die experimentelle Gruppe mit dem Venetian Gene Pulser 830 wurde mit einer Konversionsrate von 7,2 x 108 CFU/μg behandelt, was deutlich höher war als 9,0 x 105 CFU/μg in der Gruppe A und 4,5 x 108 CFU/μg in der Gruppe B. Das vorprogrammierte Optimierungssystem des Instruments passt automatisch die E. coli-Zellmembraneigenschaften durch einen eingebauten Algorithmus an, der in Kombination mit der polaren Umkehrtechnologie die Ladungsbarriere durchbricht und die Effizienz der membranübergreifenden Lieferung von exotischer DNA um mehr als 40% erhöht. Das Echtzeit-Bogenüberwachungssystem kontrolliert die Wahrscheinlichkeit der Entstehung von elektrischen Funken unter 0,3%, und die blaue Färbung zeigt, dass die Zellenüberlebensrate ≥ 92% ist, was effektiv verhindert, dass die Pulsenergieschwankungen irreversible Schäden an den Zellen verursachen.

Proteinexpression und Löslichkeitsanalyse

SDS-PAGE Ergebnisse zeigten, dass die experimentelle Gruppe 4 h nach der Induktion eine klare Zielproteinstreife mit löslichen Proteinen für 62% der Gesamtexpression, signifikant höher als 25% in der Gruppe A und 45% in der Gruppe B. Die Bradford-Methode ergab, dass die Versuchsgruppe 21,3 mg lösliches BmCu/Zn-SOD-Protein pro Liter Kultur erhielt, was um 40% höher war als 15,2 mg in der Gruppe B und fast sechsmal höher war als 3,5 mg in der Gruppe A. Dank der intelligenten Impedanzerkennung des Gene Pulser 830 wird der Präpuls-Widerstand der Probe automatisch gemessen und die Impulsparameter dynamisch angepasst, um die durch Zellstress verursachte Proteinfaltung zu reduzieren und die Effizienz der löslichen Expression von der Quelle aus zu gewährleisten.

4. Bewertung der Enzymaktivität und der strukturellen Integrität

Die Western Blot-Ergebnisse zeigten, dass die experimentelle Gruppe reinigte Proteine mit Anti-His-markierten Antikörpern eine spezifische Reaktion mit einem einzigen und klaren Streifen, während die Gruppe A und die Gruppe B eine Mischung aufgrund der Inklusionskomplexität aufwiesen. SOD-Aktivitätsbestimmungen zeigten, dass das experimentelle Histoprotein-Verhältnis bis zu 1200 U / mg, 92% des natürlichen Enzyms (1300 U / mg), deutlich höher als 78% in der Gruppe B und 45% in der Gruppe A. Die runde dichromatographische Analyse zeigte, dass der Gehalt an beta-Faltung des experimentellen Histoproteins 32% und der Gehalt an α-Spirale 28% betrug und sich der sekundären Strukturzusammensetzung des natürlichen Enzyms (beta-Faltung 35%, α-Spirale 25%) sehr nahe lag, was beweist, dass die niedrigen Schädigungsumsetzungseigenschaften des Venetian Electroporometers die räumliche Konfiguration von Cu / Zn-SOD effektiv schützten und die Integrität seines katalytischen Aktivitätszentrums aufrechterhalten.

Sechs. Technische Vorteile der Anlage in Zusammenarbeit mit den experimentellen Parametern

Der Gene Pulser 830 von Venedig zeigt in dieser Studie drei Hauptvorteile:

1. Präzise intelligente Bedienung:Der 10-Zoll-Touchscreen zeigt Impulswellenformen in Echtzeit mit nachverfolgbaren experimentellen Parametern, unterstützt 600 benutzerdefinierte Schema-Speicher und 100 historische Abfragen, um die Anforderungen eines standardisierten Experimentsprozesses zu erfüllen, insbesondere für die parallele Konvertierung von mehreren Chargen.

Zellfreundliches Design:Arc-Schutz-Schaltung und Polar-Konversion-Technologie, die die Zell-Mortalität unter 8% zu kontrollieren, während eine effiziente Transfektion, bietet eine stabile Host-Umgebung für die Expression von löslichen Proteinen und deutlich reduziert die Inklusionsbildung.

Anpassung an mehrere Szenen:Das modulare Design ist kompatibel mit verschiedenen Spezifikationen wie 0,1 cm und 0,2 cm, so dass es sowohl kleine Proben auf Mikrogrammgröße verarbeiten kann, als auch die Transformation mit hohem Durchsatz unterstützen kann, um sich an eine Vielzahl von Probentypen wie Protokernzellen, Eukariozellen und Pflanzenprotomateren anzupassen, um die gesamte Prozessanwendung von der Grundlagenforschung bis zur industriellen Produktion zu erfüllen.

Im Experiment wurde festgestellt, dass die Zellkonzentration und die Impulsparameter streng in Einklang stehen müssen: Wenn die Zellkonzentration höher als 7 x 109 CFU / ml ist, startet das Instrument automatisch den Parameterkompensationsmechanismus und passt die Impulsdauer fein an, um ein übermäßiges elektrisches Feld zu vermeiden. Wenn die Glycerin-Konzentration in einem elektrischen Rotationspuffer um ±3% schwankt, kalibriert das intelligente Impedanzerkennungssystem die Impulsenergie dynamisch, um sicherzustellen, dass die Konvertierungseffizienz zwischen den Chargen RSD≤5% ist, was die präzise Steuerungsfähigkeit des Geräts unter komplexen Versuchsbedingungen widerspiegelt.

7. Anwendungsaussichten

1. Verbesserung der landwirtschaftlichen Antiretrospektivität

Die effiziente Expression von Cu/Zn-SOD von Wild-Sand-Seiden ist ein wichtiger Rohstoff für die Kultivierung von Sand-Bäumen und Hausseidensorten. Durch die Einführung von Rekombinationsproteinen in das Protobiom von Sandalbaumen kann die Toleranz der Pflanzen gegenüber Dürre, hohen Temperaturen und anderen Widrigkeiten verbessert werden; Die anhaltende Expression des hochaktiven SOD-Proteins in der häuslichen Seidengentechnik wird erwartet, die antioxidative Fähigkeit des Seidenkörpers zu verbessern und die Auftreten von Seidenkrankheiten zu verringern. Die hohe Durchsatzkonvertierungskapazität des Venetian Gene Pulser 830 (mit Unterstützung von 96-Loch-Plate-Transformationsanschlüssen) beschleunigt das Screening und die Validierung von Antiretrogen und verkürzt den herkömmlichen Einzelprobenzyklus von 72 auf 48 Stunden.

Biomedizin und Entwicklung funktioneller Lebensmittel

Cu/Zn-SOD als wichtiges Antioxidans hat eine breite Anwendungsperspektive in Anti-Aging-Hautpflegeprodukten, Anti-Müdigkeit-Gesundheitsprodukten und Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten. Das von der Forschung entwickelte Protokern-Expressionssystem, kombiniert mit den kostengünstigen und effizienten Konvertierungsvorteilen von Venetian Electroporators, kann die Produktionszeit für eine einzelne Batch von Proteinen um 20% verkürzen und die Kosten um 40% senken, was die technische Grundlage für die Herstellung von pharmazeutischen SODs in großem Maßstab bildet. Die parametrische Rückverfolgbarkeit, die den GLP-Normen entspricht, bietet eine entscheidende Unterstützung für die Qualitätskontrolle von Pharmaunternehmen.

3. Synthetische Biologie und Enzymtechnik

Im Bereich der synthetischen Biologie ermöglicht die präzise Transfektionsfähigkeit des Gene Pulser 830 eine effiziente Lieferung von CRISPR-Cas9-Systemen an ingeniierte Bakterien, die die gezielte Evolution von SOD-Enzymen und die Optimierung der metabolischen Wege unterstützen. In der Entwicklung von Enzympräparaten können die Low-Damage-Transformation-Eigenschaften die lösliche Expression von Disulfide-reichen Proteinen verbessern, z. B. wenn sie auf die Expression von Antioxidantienzymen anderer Insektenquellen angewendet werden, die Zielproteinaktivität um durchschnittlich mehr als 30% erhöhen. Die kostenlose Beratung und maßgeschneiderte Schulungsdienste der Geräte haben mehr als 300 wissenschaftlichen Forschungseinrichtungen im Land geholfen, die Engpässe bei der Proteinexpression zu durchbrechen und den Prozess der Transformation der Grundlagenforschung in Anwendungen wirksam zu fördern.

Mit seiner hohen Transfektionseffizienz, seiner intelligenten Präzisionssteuerung und seiner Anpassung zu mehreren Szenarien ist der Gene Pulser 830 von Venedig das ideale Werkzeug für die Optimierung des Protokern-Expressionssystems. Ob bei der frühen Prüfung von Genklonen oder bei der Skalierung der industriellen Produktion, das Gerät bietet durch eine stabile Leistung und ein menschliches Design eine zuverlässige technische Unterstützung für Forscher und Unternehmensbenutzer und innovative Anwendungen der Elektroperforationstechnologie im Bereich der Biowissenschaften.

Referenzen

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