Am 4. April 2025 im California Scripps Institutevon Kendall W. NettlesundProfessor John R. Yates III veröffentlichte einen Artikel mit dem Titel „Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer“ in der Fachzeitschrift Nature Chemical Biology.Dieser Artikel entwickelte eineNative top-down Proteomik (nTDP) Strategiezur Identifizierung von Proteokomplexen von ≤70 kDa in Brustkrebszellen, einschließlich eines endokrinen Resistenzmodells für die Überexpression von Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR).104 Komplexformen aus 17 Proteinkomplexen(spezifische Montageformen von Proteinkomplexen). Die Studie ergab, dass EGFR die Isolation des Nuklearen Transportfaktors 2 (NUTF2) auslöst, während die K4- und K55-translationsmodifizierten Stellen von NUTF2 einen differenzierten Einfluss auf die Unterdrückung der Östrogenrezeptor-Signalwege (ER) haben. Die Studie enthüllt die molekularen Eigenschaften des Brustkrebsproteinoms und die Rolle von Complexoformen bei Tumorwachstum und Therapieresistenz und bietet neue Perspektiven für das Verständnis der Krankheitsmechanismen und die Entwicklung von Medikamenten.

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eins

Forschungshintergrund

Die jüngsten Daten der Internationalen Agentur für Krebsforschung der WHO zeigen, dass im Jahr 2020 weltweit 2,26 Millionen neue Fälle von Brustkrebs auftreten, mehr als 2,2 Millionen Fälle von Lungenkrebs. Brustkrebs hat Lungenkrebs ersetzt und ist der größte Krebs der Welt. Proteine bilden erfolgreiche Komplexe durch nicht-covalente Wechselwirkungen, die fast alle Schlüsselfunktionen in der Zelle betreiben, die mit bösartigen Tumoren wie Brustkrebs zusammenhängen, während Proteine durch Differenzclipping, Sequenzwarianten, Posttranslationale Modifikationen (PTMs) oder Mutationen durch eine Vielzahl von Proteoformen entstehen, die die Bildung, Stabilität und Aktivität dieser funktionellen Komplexe beeinflussen. Traditionelle bottom-up-Proteomik-Methoden haben Einschränkungen bei der Erklärung von Proteoformen, die von einzelnen Proteinen erzeugt werden, bei der Charakterisierung von Liganden und Cofaktoren, die an Proteinkomplexe gebunden sind, und bei der Abbildung von kombinierten PTM-Mustern. Native Top-down Proteomics (nTDP), die durch die Kombination von Native MS und Top-down Proteomics (Top-down Proteomics) gebildet wird, hat zwar eine strukturelle Analysefähigkeit, aber aufgrund der geringen Fülle an Proteinkomplexen in komplexen Bioproben, der Schwierigkeiten bei der Isolierung von Proteinkomplexen und des Mangels an bioinformatischen Werkzeugen für den Umgang mit großen nTDP-Datensätzen, wird nTDP derzeit weniger in komplexen Bioproben verwendet, die hauptsächlich für die Analyse gereinigter Proteinkomplexe verwendet werden. In der Brustkrebsforschung ist die Wachstumsfaktorsignalisierung einer der wichtigsten Mechanismen der endokrinen Therapieresistenz, wobei die Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und die Mutation der nachgelagerten Signalkomponenten mit der klinischen Tamoxifen-Resistenz verbunden sind, aber der spezifische Mechanismus ist noch nicht klar. Daher ist ein effektiver Ansatz zur Untersuchung der Eigenschaften der Proteinanordnungen in Brustkrebszellen erforderlich, um die molekularen Mechanismen der Krankheit zu verstehen und wirksame Medikamente zu entwerfen, was den Hintergrund und den Antrieb für die Entwicklung und Anwendung der nTDP-Strategie für diese Studie bietet.

zwei

Forschungsmethoden

1

Forschungsgebiete:

MCF-7-Brustkrebszellen, die positiv für den Östrogenrezeptor α (ERα) sind (nachfolgend MCF-7-Zellen) und MCF-7-Zellen, die den Epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) überexprimieren (nachfolgend MCF-7-EGFR-Zellen als resistentes Modell für ER-gezielte Therapien).

2

nTDP-Arbeitsabläufe

Der von den Forschern entwickelte nTDP-Arbeitsablauf, wie in Abbildung 1 gezeigt, wird zunächst ein löslicher Proteinkomplex aus der Zelle zur Isolierung mit Offline-nativer Dimensions-Blockierchromatografie (nSEC) extrahiert; Anschließend durch nano-ESI-FAIMS-MSn (Flüssige Phase: Easy-nLC 1200, Gasphase-Trennung: FAIMS, Massenspektrum: Orbitrap Fusion Lumos)Native Top-Down Analyse von Proteinkomplexen Letzte VerwendungProSight Native istDie Software löst komplexe Massenspektrumdaten in Kombination mit manueller Korrektur.

Abbildung 1: nTDP-Workflow (klicken, um das Bild zu vergrößern)

Drei.

Forschungsergebnisse

1

nTDP-Workflow-Verifizierung

Die Forscher verwendeten zunächst drei Proteinkomplexe: carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa) Um die Reproduzierbarkeit und Robustheit des nano-ESI-FAIMS-MSn-Systems zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass das System Proteinkomplexe stabil isolieren und zerbrechen kann, um Massenspektrumdaten zu erzeugen, die effektiv die Charakteristik der Proteine aufklären können (Abbildungen 2-4). Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass FAIMS Proteinkomplexe bis zu 70kDa auf Gasphasenebene isolieren kann. (Abbildung 5)

Abbildung 2: Das nTDP-Spektrum von CA II und sein von ProSight Lite generiertes Fragment-Diagramm (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Abbildung 3: Das nTDP-Spektrum von SA und sein von ProSight Lite generiertes Fragment-Diagramm (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Abbildung 4: Das nTDP-Spektrum von AV und das von ProSight Lite generierte Fragment-Diagramm (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Abbildung 5: Basispitzenmigrationsdiagramm für Standard-Proteinkomplexe und deren CV-Werte

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2

nTDP Analyse von MCF-7 und

MCF-7-EGFR Zellenextrakt

Anschließend isolierten die Forscher Zelleextrakte aus Brustkrebszellen (MCF-7 und MCF-7-EGFR) mit dem nSEC-System, und die nSEC-Spektrergebnisse zeigten, dass der Proteinkomplex aus MCF-7 und MCF-7-EGFR (16 wiederholte Versuche) eine stabile und effektive Isolation ermöglichte. Der isolierte Proteinkomplex wird mit dem Nano-ESI-FAIMS-MSn-System getestet und gemessen.104 Komplexformen von 17 ProteinkomplexenDazu gehören Protein-Metallkomplexe, Protein-Protein-Metallkomplexe und Protein-Proteinkomplexe.

Abbildung 6: nSEC-Spektrum von Proteinmarkern und Proteinakollektoren in MCF-7, Proteinakollektoren in MCF-7-Zellen, nSEC-Spektrum von Proteinmarkern und Proteinakollektoren in MCF-7-EGFR, Proteinakollektoren in MCF-7-EGFR-Zellen. (Klicken Sie auf das große Bild)

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Charakterisierung von Proteinkomplexen im Zusammenhang mit Brustkrebs

• TPI-Komplexformen:TPI ist ein Glykolysase, das mit Brustkrebs verbunden ist, und es gibt Studien, die darauf hindeuten, dass TPI mit Medikamentressistenz, Tumorprogression und Metastasen verbunden sein kann. Die Forscher beobachteten die TPI-Diomer-Struktur sowohl in MCF-7 als auch in MCF-7-EGFR-Zellen mit einer Molekulargewicht von etwa 53 kDa (nSEC-Fraktion 4). Der Dimer-TPI-Komplex wird durch eine Kombination von abgekürzten und phosphorisierten monomeren Proteinvarianten gebildet, bei denen zwei Dexamide (N15 und N71) auf den monomeren Proteinvarianten auftreten. Die Forscher haben auch einen TPI-Komplex entdeckt, der aus einem mutierten (E104D) TPI-Monomer gebildet wird, und TPI der E104D-Monomer-Untereinheit kann phosphorisiert, deamiziert oder acetyliert werden.

Abbildung 7: nTDP-Spektrum des TPI-Complexoforms-Komplexes in MCF-7-Zell-Extrakt (Klicken Sie auf das große Bild)

• MIF-Komplexformen:MIF ist ein multifunktionales Zytokin, das biologisch relevant für eine Vielzahl von Krebs, Autoimmunerkrankungen und Entzündungen ist, und die Forscher fanden heraus, dass MIF sowohl in MCF-7- als auch in MCF-7-EGFR-Zellen hoch ausgedrückt ist, und das native MS1-Spektrum liefert detaillierte Informationen über MIF-Komplexformen, die insgesamt fünf MIF-Tripolymerstrukturen bilden (homogene und heterogene). Durch MSnDie spektrographische Analyse ergab abgekürzte, unmodifizierte, nitrizierte und acetylierte MIF-Monomerproteinvarianten (Nitro- und Acetylierung auf C80 bzw. K77).

Abbildung 8: nTDP-Spektrum des MIF-Complexoforms-Komplexes in MCF-7-Zell-Extrakt (Klicken Sie auf das große Bild)

SOD1-Komplexformen:Metallenzym SOD1 ist ein wichtiges Antioxidans, das bei der Krebsgen-getriebenen Brusntumorbildung und der Umwandlung von Superoxiden in O2und H2O2Wichtig. Die Forscher beobachteten die SOD1-Diomer-Struktur mit einer molekularen Masse von etwa 32 kDa in MCF-7- und MCF-7-EGFR-Zellen und beobachteten Cu in SOD1-Protein-Varianten-Untereinheiten sowohl im MS1-Spektrogramm (11 + Ladungszustand) als auch im MS2-Spektrogramm (6 + Ladungszustand).2+und Zn2+Nicht-kovalente Bindungen von Metallionen, die SOD1-Protein-Variante bringt auch die N-End-Acetylierung, die Entfernung eines Paares von Dischwefelbindungen (C57-C111) und N-End-Methylthin.

Abbildung 9: nTDP-Spektrum des SOD1-Komplexformen-Komplexes in MCF-7-Zell-Extrakt (Klicken Sie auf das große Bild)

• NUTF2-Komplexformen:NUTF2 ist ein Dimerprotein, das den intranuklearen Transport des kleinen GTP-Enzyms Ran vermittelt. Die Forscher identifizierten insgesamt acht Varianten des NUTF2-Proteins aus MCF-7- und MCF-7-EGFR-Zellen, die sich in 26 verschiedenen Komplexformen verteilten. Aus der MS1-Spektrographie wurde festgestellt, dass der Gehalt an endogenen NUTF2-Dimeren-Komplexen in MCF-7-EGFR im Vergleich zu MCF-7-Zellen signifikant reduziert ist und dass die drei acetylierten NUTF2-Isomere MCF-7-EGFR-Zellen spezifisch sind.

Abbildung 10: nTDP-Spektrum von NUTF2 in MCF-7 und MCF-7-EGFR-Zelleextrakten (Klicken Sie, um das große Bild zu sehen)

Abbildung 11: Intensitätsinformationen zu NUTF2-Komplexformen und Proteoformen in MCF-7- und MCF-7-EGFR-Zelleextrakten (Klicken Sie für eine größere Abbildung)

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4

NUTF2 vermittelt die Wechselwirkung zwischen EGFR und ER-Wegen

Die Ergebnisse der früheren nTDP-Daten ergaben, dass die Anzahl der NUTF2-Dimere in MCF-7-EGFR-Zellen signifikant niedriger war als in MCF-7-Zellen, und die Forscher haben NUTF2 mit zwei verschiedenen Affinitätsmarken zusammen abgesetzt, um zu bestätigenEGFR induziert die Auflösung des Kerntransportfaktors 2 (NUTF2)Die post-translational-modifizierte (PTM)-Stelle von NUTF2 ist bei Wirbeltieren konservativ, und die Kristallstruktur des NUTF2-Proteinkomplexes zeigt, dass K4 in der Nähe der Nukleoporprotein-Bindungsstelle liegt. K55 und K63 liegen in der Nähe der Ran-Bindungsstellen, an denen K55 am wassermittelten Kontakt zwischen Ran und NUTF2 beteiligt ist, so dass die Forscher die K4- und K55-Stellen mutierten. Die Ergebnisse zeigen,Die Expression von NUTF2 in MCF-7-Zellen hemmt das Wachstum von Brustkrebszellen, die durch die K4Q-Mutation umgekehrt und die K55R-Mutation verstärkt wird.Dies deutet darauf hin, dass PTM-Stellen (K4, K55) das Zellwachstum regulieren können, indem sie die Nukleoporbindung oder die Ran-Interaktion beeinflussen. NUTF2 reduziert das östrogeninduzierte Gen GREB1, während die K4Q-Mutation diesen Phänotyp ohne 4OHT wiederherstellen kann. Dies deutet darauf hin, dass NUTF2 Proteoforms an verschiedenen PTM-Stellen zu unterschiedlichen biologischen Ergebnissen führen.

Abbildung 12: NUTF2 reguliert die Signalleitung von ER und hemmt das Wachstum

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Um weiter zu untersuchen, wie NUTF2 die ER-Signalisierung und die Reaktion auf 4OHT reguliert, wurde durch die CUT & RUN-technische Analyse festgestellt, dass die Bindungsstellen von ER und NUTF2 in MCF-7-Zellen im Wesentlichen nicht überlappen, aber die NUTF2-Expression und die 4OHT-Behandlung ändern das Bindungsmuster von ER. NUTF2-Expression führt zu Unterschieden in der Bindung von ER an 1353 Stellen und nach 4OHT-Behandlung von MCF-7 und MCF-7NUTF2Die ER-Bindungsstellen der Zellen überlappen sich und unterscheiden sich. Allerdings wurden nur 132 gemeinsame ER-Basis-Sequenz-Halbstätten (d.h. "1-AGGTCA") an 4OHT-empfindlichen NUTF2-Stellen gefunden, was darauf hindeutet, dass NUTF2 ER-Chromatin-Anteil und -Aktivität durch indirekte Mechanismen reguliert. Um die molekularen Mechanismen der NUTF2-Wachstumssuppression besser zu verstehen, haben die Forscher die RNA-Sequenz von MCF-7- und MCF-7NUTF2-Zellen abgeschlossen, und die Analyse der Genset-Anreicherung zeigte, dass mehr als 600 Differenzen in der Expression von Genen vorliegen, darunter Gene, die mit dem RNA-Abbau verbunden sind, die Komponenten des NuRD-Komplexes (wie HDAC1) und des Apoptogens ERRFI1, die mit der Mitochondrialoxidphosphorylation verbundenen Gene (wie BCL2) und die krebserregenden Gene (wie die RAS-Familiengene). Die Pathway-Enrichment-Analyse zeigte, dass diese Gene an einer Vielzahl von Krebs- und EGFR-bezogenen Wegen beteiligt sind, die die Rolle von NUTF2 als EGFR-Signalfaktor unterstützen. ERα-APEX2-Nachbarschaftsproteinomik-Studien haben gezeigt, dass die NUTF2-Expression die Interaktionsgruppen von ER verändert, einschließlich erhöhter JunB-Marker und verminderter Marker für die Tumor-Suppressionsfaktoren HSPBP1 und CSDE1. Im Vergleich zu NUTF2: WT und NUTF2: K4Q-Zellen wurden Unterschiede in der ER-Interaktionsgruppe gefunden (z. B. erhöhte CNOT9-Markierungen und verringerte DNMT3A-Markierungen), was weiter bestätigt, dass NUTF2 den Weg durch die Regulierung der ER-bezogenen Protein-Interaktionen beeinflusst.

Abbildung 13: Wechselwirkungen von NUTF2-ER

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vier

Schlussfolgerungen und Bedeutung

1

Erfolgreicher Aufbau und Anwendung der nTDP-Methodik

Die Studie optimierte den nTDP-Workflow in Kombination mit Offline-Native Dimensional Blocking Chromatography (nSEC), Nano-ESI, Field Asymmetric Ion Migration Spectrometry (FAIMS) und Multi-Stage Serial Mass Spectrometry (MSn) und identifizierte erfolgreich 104 Komplexformen von 17 Proteinkomplexen aus Brustkrebszellen (MCF-7 und MCF-7 -EGFR), darunter Protein-Metall-Komplexe, Protein-Protein-Metall-Komplexe, Protein-Protein-Komplexe usw.), die endogene Protein-Assemblages von ≤70 kDa charakterisieren können.

2

Entdeckung und Funktionsanalyse kritischer Proteinkomplexe

Schlüsselproteinkomplexe im Zusammenhang mit Krebs wie Phosphopropylaseisomerase (TPI), Makrophagemigrationshemmer (MIF), Komplexformen von Superoxiddismutase (SOD1) wurden identifiziert und ihre Posttranslationsmodifizierungsstellen (PTMs) (wie Dexamid von TPI, Phosphorylierung, Nitroxylierung von MIF, Acetylierung, Metallbindungsstellen von SOD1 usw.) und ihre Auswirkungen auf die Struktur und Funktion des Komplexes wurden identifiziert. Die EGFR-Überexpression induziert die Isolation des Nuklearen Transportfaktors 2 (NUTF2). Das NUTF2-Dimer ist als Nukleopor-Shuttle-Protein am nuklearen Input von RAN beteiligt, dessen Überexpression das Wachstum von Brustkrebszellen hemmt, während Mutationen an verschiedenen PTM-Stellen (K4 und K55) diesen Hemmungseffekt umkehren oder verschärfen, was darauf hindeutet, dass NUTF2-PTMs das Wachstum von Brustkrebs beeinflussen, indem sie den Östrogenrezeptor-Signalweg (ER) regulieren.

3

Der Zusammenhang zwischen NUTF2 und endokriner Brustkrebsresistenz

NUTF2 beeinflusst das Wachstum von Brustkrebszellen durch indirekte Regulierung von ER-DNA-Bindungs- und Protein-Interaktionsnetzwerken, die ER-Signalwege beeinflussen, wie z. B. das östrogeninduzierte Reproduktionsgen GREB1, das apoptotische Gen ERRFI1 und so weiter. EGFR-Überexpression (Modell der Endokrinentherapie-Resistenz) verringert die NUTF2-Dimerspiegel und ändert das PTMs-Muster, was zu einer anormalen regulierenden Wirkung von NUTF2 auf das ER-Signal führt, was wahrscheinlich einer der wichtigen Mechanismen der EGFR-vermittelten Tamoxifen-Resistenz ist.

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Die Bedeutung von nTDP

Diese Methode bietet ein neues Paradigme für die Massenanalyse von endogenen Proteinkomplexen in komplexen biologischen Proben, die in der Lage sind, zerbrechliche nicht-kovalente Wechselwirkungen beizubehalten, PTMs, Montagemuster und Ligandbindungen von Proteoformen präzise zu charakterisieren, neue Wege für die Krebsbiologie, die Entdeckung von Arzneimittelzielen und die Strukturbiologie zu eröffnen, insbesondere für das Verständnis der molekularen Mechanismen der Brustkrebsresistenz.

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