Matrix-Effekt / Matrix-Interferenz bezieht sich auf andere Substanzen in der Probe, die Auswirkungen auf die Fähigkeit haben, das Ziel-Analyte zu erkennen, am häufigsten bei Immundetection von biologischen Proben wie Serum, Plasma, Gewebehomogeneität usw., da viele Komponenten in diesen Proben wie Kohlenhydrate, Proteine, Phospholipide, Metabolite usw. die Bindung von Antikörpern an ihre Ziele stören oder das Signal hemmen oder verstärken können, um die genaue Menge des Analyten zu beeinflussen.

In der biologischen Analyse in klinischen Studien stellt die Interferenz der Matrix eine große Herausforderung dar, z. B. in Serum und Plasma wurden verschiedene Arten von Interferenzen festgestellt, in der Regel endogene Substanzen wie Rheumatoide, heterophile Antikörper (mit niedriger Affinität und schwacher Bindung gegen unkläre Antigene), menschliche Antikörper gegen Tiere (HAAA, hohe Affinität, die beim Kontakt des Immunsystems mit tierischen Antikörpern erzeugt wird) und andere Plasmaproteine wie Albin, Lyosase, Fibrogen usw. [1] Diese Interferenzfaktoren beeinflussen direkt die Empfindlichkeit, Spezifizität und Variabilität des Tests, was zu ungenauen Quantifizierungen der Analyten führt.

Die grundlegendste Methode zur Reduzierung des Matrixeffekts ist die Verdünnung der Probe, jedoch unter der Voraussetzung, dass die Spiegel des verdünnten Analyten immer noch im linearen Bereich liegen und die Verdünnung die Detektionsempfindlichkeit beeinflusst, so dass es keine allgemeine Strategie ist. Die Optimierung des pH und der Ionenstärke des Puffers hilft auch, nicht spezifische Wechselwirkungen zu verringern. Andere Strategien zur Überwindung von Störungen umfassen die Einbindung von Substanzen, die sich an Störungsmoleküle binden oder konkurrieren, wie die passive Entfernung von menschlichen Anti-Ratten-Antikörpern (HAMA) mit geeigneten Tierserumcocktails, die Verwendung von Heterophilen Antikörper-Inhibitoren wie Heterophile Blockierende Reagentien (HBR) und Immunglobulinsuppressive Reagentien (IIR) oder die Verwendung von F(ab′)2 oder Einkettenfragmenten (scFv) ohne Fc-Fragmente als Erfassungs-/Detektionsreagenzien [3], obwohl diese Methoden in den meisten Fällen arbeitsintensiv und teuer sind und nicht praktisch für große Probenvolumen sind.

Bei Immunotests basierend auf dem Ligand-Bindungsassay (LBA) hat sich die Verkürzung der Inkubationszeit oder der Zeit, in der das Reagentium in Kontakt mit der Matrix steht, als eines der wirksamen Mittel erwiesen, um die Matrixeffekte zu überwinden [4].Gyrolab ® Ein affinitätsförmiger Durchlaufmodus auf einer mikrofluidisierten CD wird realisiert, wodurch die Kontaktzeit des Reagents mit der Matrix minimiert und die Interferenz der Matrix minimiert wird.Shannon D. Chilewski et al. von Bristol-Myers Squibb [5] verwenden Gyrolab ® Die Plattform löst das Problem der Matrixstörung in präklinischen PK-Studien.

In diesem Fall wurde eine Matrixstörung durch menschliche Antikörper gegen Tiere (HAAA) beim PK-Test eines PEG-Antikörpers beobachtet. In der Phase der Drogenentdeckung basiert die Testmethode, die zur Unterstützung der Single Ascending Dosis (SDA) Studie verwendet wird, auf der Methode der elektrochemischen Luminescenz-Detektion (ECL), mit Zielmolekülen als Erfassungsreagens, Ziegen-Anti-Vk-Antikörpern als Testreagens mit einer 50-fachen Probenverdünnung und einer quantitativen unteren LLOQ von 80 ng / ml.

Aber beim Übergang von der Entdeckungsphase zur Entwicklungsphase ist eine geringere Detektionsempfindlichkeit erforderlich und gleichzeitig Genauigkeit und Genauigkeit aufrechterhalten oder verbessern, und LLOQ der ECL-Detektionsmethode 80ng / ml ist aus drei Gründen nicht mehr geeignet, um die nächste Phase der Forschung zu unterstützen:

1 Das Entwicklungsteam interessiert sich für die Halbwertszeit des Arzneimittels bei niedrigeren Dosen, die bei der Anwendung der aktuellen Testmethode

Die Medikamentkonzentration im Zyklus zu messen, wenn der Rezeptoranteil EC50 bei 78 ng/ml liegt;

3 Im Falle einer Immunogenität können resistente Antikörper eine Clearance-Wirkung auf das Medikament haben und den Medikamentspiegel im Kreislauf senken, so dass die Schlussfolgerung, dass diese Testmethode die Dosierung des Medikaments bei niedrigeren Dosen weiter einschränkt.

　Um die Messempfindlichkeit zu erhöhen und die LLOQ auf die gewünschte 30ng/mL zu erweitern, hat das Forscherteam die Verwendung von Gyrolab untersucht. ® Die Plattform und die neue Reagenzkombination ermöglichen die schnelle Entwicklung neuer Testmethoden in begrenzter Zeit.

Zunächst im Gyrolab ® Die Kombination von Erfassungs- und Detektionsreagenzien wurde mit Ziegenpolyklonaresistenten Antikörpern als Erfassungsreagens und Maus-Antimonomab als Detektionsreagenzien gescreent, und diese Kombination zeigte die beste Leistung mit einer Erfassungskonzentration von 100 µg/ml und einer Detektionskonzentration von 2500 ng/ml. Verwendung von Gyrolab ® Bioaffy 200 CD (Probenvolumen 200 nL) und Standard-Gyrolab ® Die dreistufige Methode (Erfassung-Analysat-Detektion) wird analysiert und die Probe wird mit einer MRD von 2 verdünnt.

PBS-T als Verdünnungspuffer (PBS + 1% BSA + 0,05% Tween-20) wird die Probe zweimal verdünnt. In drei Tagen wurden sechs CD-Tests durchgeführt. Jede CD enthält eine Standardkurve und vier Wiederholungen von 6 Ebenen QC-Proben. Der Standardkurvenbereich beträgt 30-2000ng / mL und der Ankerpunkt beträgt 2500ng / mL. Die QC-Probe wird 125-mal in 100% menschlichem Serum verdünnt und dann doppelt mit einem Testpuffer verdünnt, um die Konzentration in den Messbereich zu bringen. Tabelle 1 zeigt eine gute Präzision und Genauigkeit aller Ergebnisse.

Parallelvergleich der Verdünnungsproben mit PBS-T-Puffer und dem patentierten Rexxip H-Puffer (Gyros). Da das Testverfahren Mausmomab enthält, ist der menschliche Anti-Maus-Antikörper HAMA eine potenzielle Störungsquelle und der Rexxip H-Puffer enthält die Komponente eines neutralen heterophilen Antikörpers, so sollte die Verdünnung mit Rexxip H in der Lage sein, das Signal der Matrix-Störungen zu hemmen.

20 Serumproben (10 normales menschliches Serum NHS1-10 und 10 DPS1-10 in der Patientenpopulation) wurden mit einer LLOQ-Konzentration von 30 ng/ml analysiert und alle 20 Proben wurden nicht markiert. Akzeptanzkriterien: 80 % der markierten Proben müssen innerhalb einer Abweichung von ± 25 % der Nennkonzentration zurückgewonnen werden und alle nicht markierten Proben müssen weniger als LLOQ zurückgewonnen werden. Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigen, dass normale menschliche Serumproben nach Verdünnung mit Rexxip H-Puffer die Zielakzeptanzkriterien erfüllten. Normale menschliche Serumprobe Nr. 2 mit einer Rückgewinnungsrate von 252,6% mit PBS-T und einer Rückgewinnungsrate von weniger als 25% mit Rexxip H zeigt, dass Rexxip H-Puffer sehr gut die Interferenz der Matrix in der Probe beseitigt. Zwei dieser Krankheitserumproben hatten eine umgekehrte Konzentration von 32 bis 35 ng/ml, selbst wenn Rexxip H-Puffer verwendet wurde. Daher ist es notwendig, das Labeling-Experiment zu wiederholen, um LLOQ auf 40 ng / mL zu entwerfen.

Zusammenfassung:

Übertragung der elektrochemischen Leuchtmittelprüfung (ECL) (LLOQ 80ng/mL) auf Gyrolab ® Auf der Plattform wurden mit optimierten Antikörper-Paaren und Puffern empfindlichere Testergebnisse erzeugt, die LLOQ auf 30ng/mL verbessert haben, um den Anforderungen zukünftiger Studien gerecht zu werden.

Gyrolab ® Die Plattform-Affinitäts-Säulendurchlaufmuster und der patentierte Rexxip-Puffer minimieren die Abnahme der Datengenauigkeit und Empfindlichkeit durch den Matrixeffekt.

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Referenzen:

[1]. Selby C. Interferenz in der Immunoassay. Ann, die Klinik. Biochemie. 36(Nr. 6), 704–721 (1999).

[2]. Ana I. Barbosa und Nuno M. Reis. Antikörper Oberflächenabdeckung treibt Matrix Interferenz in Microfluidic Kapillar Immunoassays. ACS Sensoren 2021 6 (7), 2682-2690.

[3]. Williams K, Erickson R, Fischer SK. Überwindung des krankheitsspezifischen Matrixeffekts in einem klinischen pharmakokinetischen Assay mittels einer mikrofluidischen Immunoassay-Technologie. Bioanalyse, 9(16), 1207–1216 (2017).

[4]. Saloumeh K. Fischer. Ligandbindungsassay-Technologien: Passen Sie das richtige Werkzeug an Ihre bioanalytische Herausforderung. https://www.bioanalysis-zone.com.

[5]. Shannon D. Chilewski. Die Behandlung von Matrixeffekten in Ligandbindungsassays durch den Einsatz neuer Reagenzien und Technologien. Bioanalyse (2014) 6(8), 1059–1067.