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Wie man die Analyse von Wirtszellproteinrückständen (HCP) effizienter und zuverlässiger macht
Datum:2024-12-10Lesen Sie:1
Wirtszellproteine (HCP) sind nicht-Zielproteine, die von Wirtszellen (CHO, HEK293, E.coli, Sf9 usw.) produziert oder kodiert werden, und sind der Hauptbestandteil der prozessbezogenen Verunreinigungen in Biomedikamenten. Obwohl die überwiegende Mehrheit der Wirtszellproteine (mehr als 99%) im nachgelagerten Prozess entfernt werden, kann es immer noch eine geringe Menge an HCP-Resten geben, die mit Arzneimittelprodukten gereinigt werden, von denen einige als HCPs mit hohem Risiko angesehen werden, die immunogene, biologisch aktive oder enzymatische Aktivität haben können, oder möglicherweise Produktmoleküle oder Zusatzstoffe abbauen, die einen wichtigen Einfluss auf die Qualität und Sicherheit von Arzneimitteln haben, so dass solche HCPs mit hohem Risiko ein Schwerpunkt für Pharmaunternehmen und Aufsichtsbehörden sind.
Das CHO-Expressionssystem für chinesische Hamster-Eierstocksellen ist seit langem eines der häufig verwendeten Säugetier-Expressionssysteme in der Herstellung von biotechnologischen Medikamenten wie Monomab, da es in der Lage ist, komplexe, translationsmodifizierte Proteine zu produzieren, die ähnlich wie die vom Menschen produziert werden. Die nachgelagerte Reinigung von CHO-Zellkulturen umfasst in der Regel eine Protein-A-Affinitätsschicht, gefolgt von reinen Schritten zur weiteren Entfernung von Aggregaten, Ladungsvarianten, HCP und WirtszellenDNA. Die überwiegende Mehrheit der HCP wird während der Reinigung entfernt, aber es kann sein, dass einige HCP aufgrund der folgenden beiden Möglichkeiten "entkommen" werden:
1
HCP hat die Fähigkeit, sich mit Produktspezifischkeiten oder Nichtspezifischkeiten zu verbinden und wird während des Prozesses transportiert;
2
HCP hat die Fähigkeit, mit dem Protein-A-Chromatografie-Füllstoff zu interagieren, wodurch es gemeinsam mit dem Produkt gespült wird.
HCP Gefahren und Klassifizierung
Das potenzielle Risiko von HCP wird von einer Vielzahl von Faktoren beeinflusst, darunter Indikationen, Verabreichungswege, Verabreichungshäufigkeit, die Anzahl von HCP pro Dosis, die Patientengruppe, die Homogenität von HCP mit menschlichen Kollegen und frühere nicht-klinische und / oder klinische Erfahrungen.
Potenzielle Auswirkungen von HCP auf Produktqualität, Sicherheit und Wirksamkeit:
Immunogenität:Antikörper gegen Medikamente, induzieren die Produktion von Zytokinen usw.
Wirksamkeit:Protein Aggregation oder Abbau
Stabilität: Lipase Abbau Zusatzstoffe
Sicherheit:Wechselwirkung mit endogenen Proteinen, Wirkung von immunoiden Hilfsmitteln
Die BPDG-HCP-Arbeitsgruppe unterteilt die Auswirkungen von HCPs mit hohem Risiko in vier Hauptkategorien basierend auf der Fähigkeit eines einzelnen HCPs zur Co-Reinigung mit dem Produkt, der Häufigkeit des Auftretens im nachgelagerten Prozess, seiner Fähigkeit, Medikamente / Zusatzstoffe zu ändern oder abzubauen und der potenziellen Immunogenität:
1) Produktqualität, 2) Präparate, 3) direkte biologische Funktion auf den menschlichen Körper und 4) Immunogenität.
Derzeit gibt es eine Vielzahl von Methoden, um das Niveau der gesamten und einzelnen spezifischen HCPs, die während der Medikamententwicklung vorhanden sind, zu identifizieren und zu quantifizieren. Jede Methode hat ihre Vorteile und Nachteile. Bekannte HCP-Verunreinigungen können nach folgenden umfassenden Analysestrategien korrekt gemessen werden und, wenn sie als HCP mit hohem Risiko identifiziert werden, Kontrollstrategien zur Überwachung und/oder Beseitigung dieser Verunreinigungen entwickelt werden.
01 Die Messung des GesamtHCP durch Immunoassays wie ELISA ist das wichtigste Werkzeug zur Bestimmung der restlichen HCP-Spiegel zur Leitung der Prozessentwicklung und zur Unterstützung des GMP-Batch-Freigabetests. Schlüsselragenzien, die zur Entwicklung eines GesamtHCP-Immunoassays erforderlich sind, sollten detailliert charakterisiert werden.
02 Eine zusätzliche orthogonale Methode wie 2D-Gelelektrophoresis/Western und/oder Antikörper-Affinitätsextraktion (AAE) sollte nach einer Massenspektralisierung durchgeführt werden, um die Abdeckung der kritischen Antikörper-Reagentien für das prozessspezifische HCP zu bewerten.
03 Total HCP-Immunoassays sollten regelmäßig durchgeführt werden, um den HCP-Spiegel in der Prozessprobe zu bestimmen.
04 Es wird empfohlen, orthogonale Methoden wie Massenspektrometrie und / oder zusätzliche einzelne HCP-Testmethoden zu verwenden, um die Reinheit des Produkts zu gewährleisten, insbesondere wenn Immunotests einen erhöhten GesamtHCP-Spiegel erkennen, eine nonlineare Verdünnung beobachten oder Auswirkungen auf die Produktqualität beobachten.
05 Wenn ein einzelner HCP identifiziert wird und als potenziell hohes Risiko angesehen wird:
ein
Es kann erforderlich sein, ein spezifisches Immunoassay zu entwickeln, um bekannte Verunreinigungen zu überwachen, oder eine gezielte Methode der Massenspektrometrie zu entwickeln, um den HCP-Spiegel und seine potenziellen Auswirkungen besser zu verstehen.
(b)
Wenn die festgestellten Verunreinigungen eine Enzymaktivität aufweisen, kann eine Aktivitätsmethode entwickelt werden, um die Prozess- und Produktentwicklung zu leiten, das Protein zu überwachen, zu entfernen und/oder zu deaktivieren.
(c)
Die Immunogenitätsbewertung erfolgt mittels der in silico-Methode und eine in vitro vergleichende Immunogenitätsbewertung (IVCIA) kann durchgeführt werden, wenn die Prognosen ein hohes Immunogenitätsrisiko zeigen.
d
Toxikologische Studien bewerten klinische Risiken.
Die Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse des GesamtHCP ist hauptsächlich ein Immunoassay, der in der Regel mit einer oder mehreren ELISA-Methoden getestet wird. Traditionelle ELISAs haben jedoch folgende Einschränkungen:
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Mehrere Inkubations- und Waschstufe erfordern viel Handbetrieb- und Analysezeit und ein sehr begrenzter Probendetektionsfluss;
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Ein sehr enger Dynamikbereich (±100 ng/mL) erfordert eine große Anzahl wiederholter Tests während der nachgelagerten Prozessstudie;
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Der hohe Verbrauch von Proben und Reagenzien stellt eine Herausforderung für den Nachweis bestimmter niedriger HCP-Spiegel dar, da es sehr schwierig ist, ausreichend HCP aus medizinischen Substanzen zu erzeugen. Dadurch entstehen Engpässe für ELISA, wenn es darum geht, den wachsenden Geschwindigkeits-, Durchfluss- und Probenverbrauch der nachgelagerten Prozessentwicklungsteams gerecht zu werden.
Daher wenden sich immer mehr Pharmaunternehmen an eine Hochdurchfluss-Immunanalyseplattform wie Gyrolab von Gyros, die dazu beiträgt, den Durchfluss zu erhöhen und den Umsatz zu beschleunigen.®Die Gyrolab-Technologie ist eine vollautomatische Immunanalyseplattform, die mit Mikroperlen versehen ist, die mit Kettenschimmel versehen sind, um biotinisierte Erfassungsmittel zu erfassen, die mit fluoreszierend gekennzeichneten Prüfmitteln kombiniert werden, nachdem die Probe mit dem Erfassungsmittel kombiniert ist. Diese Immunoassay im Flow-through-Modus auf der Affinitätssäule ist sehr schnell und erfordert keine Inkubationszeit, was die Zeit für die Abwicklung der Analyse sowie den Verbrauch von Proben und Reagenten im Vergleich zu herkömmlichen ELISAs erheblich reduziert. Die vollautomatische Steuerung ermöglicht eine hervorragende Wiederholbarkeit der Gyrolab-Prüfung. Die Hochdurchflussanalysemethode von Gyrolab Automation unterstützt daher effektiv die HCP-Analyse in der Prozessentwicklung und QC-Freigabetests:
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Schnelle Analyse der Umsatzeffizienz;
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Ausgezeichneter Erkennungsfluss;
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Zuverlässige Datenqualität und hohe Wiederholbarkeit der Ergebnisse.
Insgesamt verbessert diese Methode die Effizienz der Bioanalyseabteilung, reduziert die manuelle Bedienungszeit erheblich, beseitigt die Nachmessanforderungen aufgrund von Verdünnungsfehlern oder menschlichen Bedienungsfehlern und verbessert die Ausbeute, Qualität und Wiederholbarkeit der Analyseergebnisse erheblich.
