Maus Interleukin 1β (IL-1β) ELISA Kit

1.Probenart und Abnahme:

Serum：Vollblutproben, die in einem Serumscheiderrohr gesammelt wurden, werden bei Raumtemperatur platziert0.5-2Stunden oder4℃Übernachten und dann1000×gZentrifugieren20 Minuten entfernen oder auf-20℃oder-80℃Aufbewahren, aber wiederholtes Einfrieren zu vermeiden.
Blutplasma：verwendenEDTAOder Hepatin als Antikoagulant Proben zu sammeln und die Proben nach der Sammlung30Innerhalb von Minuten2-8℃ 1000×gZentrifugieren15Minuten, entfernen Sie die Reinigung erkennbar, oder setzen Sie die Reinigung auf-20℃oder-80℃Aufbewahren, aber wiederholtes Einfrieren zu vermeiden.

Organisationsverhältnis:Mit VorkühlungPBS (0,01M, pH=7,4)Spülen Sie das Gewebe, entfernen Sie das restliche Blut (rote Blutkörperchen, die in der Homoplasme spalten, beeinflussen das Messergebnis), nach dem Gewiegen wird das geschnittene Gewebe mit dem entsprechenden VolumenPBS(Allgemein drücken1:9Gewichtsverhältnis, z.B.1gGewebeproben entsprechen9 mlderPBSDas spezifische Volumen kann entsprechend den experimentellen Bedürfnissen angepasst und aufgezeichnet werden. Empfohlen inPBSHinzufügen von Protease-Inhibitoren) in den Glashomogeneizer hinzugefügt und auf Eis vollständig geschliffen. Um die Gewebezellen weiter zu spalten, können homogene Slurms mit Ultraschall gebrochen oder wiederholt gefriert werden. Schließlich wird die Flüssigkeit in5000×gZentrifugieren5~10Minuten,Entfernen kann nachgewiesen werden,Oder auf reinigen-20C oder-80℃ aufbewahren, aber wiederholtes Gefrieren zu vermeiden。

Zellulysat: Entfernen der Kulturflüssigkeit, verwendenMit PBS (0,01 M, pH 7,4) werden die Zellen wieder gewaschen. Die Zellen mit Zellen kratzen und 2-5 mL PBS (0,01 M, pH 7,4) hinzufügen. Suspendierte Zellen können weggelassen werden. Sammeln Sie die Zellsuspension, 4 ° C 1000 x g Zentrifugieren 10min, entfernen Sie das Medium und waschen Sie 3mal mit vorgekühltem PBS. Hinzufügen einer angemessenen Menge von vorgekühlten PBS oder nicht-degenerativen Zell-Lysate (Hinzufügen von Protease-Inhibitoren vor der Anwendung) zur Zellsuspension, in der Regel benötigt eine 6-Loch-Platte für ein Loch Zellvolumen von 150-250 μL PBS resuspendiert. Legen Sie die Probe in -20 ° C oder -80 ° C, so dass die Probe eingefroren wird, lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur auflösen und schmelzen Sie sie wiederholt 3 Mal, damit die Zelle vollständig zerlegt wird, und die Probe kann auch durch Ultraschall gebrochen werden, um den Zweck der Zerlegung zu erreichen. 4 ℃ 10.000 x g Zentrifuge 10min, entfernen Sie die Zellstrücke, nehmen Sie die klar erkennbar,Oder auf reinigen-20C oder-80℃ aufbewahren, aber wiederholtes Gefrieren zu vermeiden。

Zellkultur oder andere biologische Proben:Bitte1000×gZentrifugieren20Minuten, entfernen Sie die Reinigung erkennbar, oder setzen Sie die Reinigung auf-20C oder-80℃ aufbewahren, aber wiederholtes Gefrieren zu vermeiden.

2.Probenhaltung und Stabilität

Die Probe ist2-8℃Unter den Bedingungen kann gelagert werden.72h， in- 20℃oder-80℃LagerbarSechs Monate undobenNach der Sammlung der Probe, nicht einmal nachgewiesen, bitte nach einer Dosis aufteilen und einfrieren, um wiederholtes Gefrierschmelzen zu vermeiden.

Schritte:

1. Nummer: Die Probe entspricht der Mikroporennummer in der Reihenfolge, jede Platte sollte eine negative Kontrolle festlegen2 Löcher, 2 positive Kontrolllöcher, 1 leere Kontrolllöcher (leere Kontrolllöcher ohne Proben und Enzym-Markierungsmittel, die übrigen Schritte sind identisch)）。

2. Probenaufnahme: Hinzufügen von negativer Kontrolle und positiver Kontrolle in den negativen und positiven Kontrolllöchern50μl。 Dann fügen Sie 40 µl Probenverdünnung in das zu prüfende Probenloch und dann 10 µl zu prüfende Probe hinzu. Die Probe wird auf den Boden des Enzym-Markierungslochs gelegt, versuchen Sie, die Lochwande nicht zu berühren und schütteln Sie sanft.

3. Temperaturzucht: Verwenden Sie die Foliendichtung hinten37Temperatur 30Minute。

4. Flüssigkeit: wirdDie 30-fach konzentrierte Waschflüssigkeit wird mit destilliertem Wasser 30-fach verdünnt.

5. Waschen: Vorsichtig entfernen Sie die Folie und entfernen Sie die Flüssigkeit,Trocknen!Füllen Sie jedes Loch mit Waschmittel und setzen Sie es still.Nach 30 Sekunden wegwerfen, so 5 Mal wiederholen und trocknen.

6. Enzyme-Addition: Zu jedem Loch wird ein enzymatisches Reagentium hinzugefügt50μl， Außer leeren Löchern.。

7. Temperaturzucht: Verwenden Sie die Foliendichtung hinten37Temperatur 30Minute。

8. Waschen: Vorsichtig entfernen Sie die Folie und entfernen Sie die Flüssigkeit,Trocknen!Füllen Sie jedes Loch mit Waschmittel und setzen Sie es still.Nach 30 Sekunden wegwerfen, so 5 Mal wiederholen und trocknen.

9. Farbdesignation: Zuerst ein Farbdesignant für jedes Loch hinzufügender A50μlHinzufügen von FarbstoffenB50μlLeicht geschüttert,37Lichtschutz 10-20Minuten.

10.Beendigung: Beendigung pro LochFlüssigkeit50 μlBeenden Sie die Reaktion(Blau wird nun gelb)。

11.Messung: Null mit leerem Loch,450nmMessung der Wellenlängen der LöcherAbsorbierenGrad (ODWert). Die Messung sollte nach dem Zusatz der Endflüssigkeit erfolgen15innerhalb von Minuten durchgeführt.

Hinweis:

1. Vorbereitung des Reagents: Die Kits aus der Kühlumgebung sollen bei Raumtemperatur ausgeglichen werdenSie können nach 15-30 Minuten verwendet werden. Zur Vorbereitung der für ein Experiment erforderlichen Enzymetikette können die übrigen von der Mikroporplatte entfernt, versiegelt und gemäß den Anforderungen der Anleitung für den nächsten Gebrauch aufbewahrt werden.

2. Probenaufnahme: Verwenden Sie bitte im experimentellen Betrieb eine einmalige Sterilisationsaufnahme, um Verschmutzung zu vermeiden. Achten Sie bei der Probenaufnahme darauf, dass keine Blasen entstehen, fügen Sie die Probe an den Boden der Enzym-Markierungsplatte hinzu, versuchen Sie, die Löcherwand nicht zu berühren und schütteln Sie sanft. Wie bei der Zugabe von Reaktionsmitteln ist der Zeitabstand zwischen dem ersten Loch und dem letzten Loch während der Probenahme so klein wie möglich (in der Regel unterInnerhalb von 10 Minuten) wird zu groß sein, was zu unterschiedlichen "Vortemperungszeiten" führt, die die Genauigkeit und Wiederholbarkeit der Messwerte deutlich beeinträchtigen. Zur Genauigkeit der Messung wird empfohlen, die Komponente für Experimente einzustellen.

3. Temperaturzucht: Um die Verdunstung der Probe zu verhindern, legen Sie die Enzym-Markierungsplatte mit einer Abdeckung oder einer Membran im Feuchtbox beim Experiment, um die Flüssigkeitsverdampfung zu vermeiden, sollte die Platte nach dem Waschen so schnell wie möglich den nächsten Schritt durchführen, sollte die Enzym-Markierungsplatte jederzeit in einem trockenen Zustand vermieden werden, während die gegebene Temperaturzuchtzeit und -temperatur strikt eingehalten werden sollten.

4. Waschen:Konzentrierte WaschflüssigkeitmöglichEs wird.KristallisationAbsetzen, beim Verdünnen im Wasserbad erhitzen und lösenDas Waschen beeinflusst das Ergebnis nicht. Eine ausreichende Wäsche ist sehr wichtig und die Waschflüssigkeit* muss bei jedem Waschvorgang getrocknet werden. Die restliche Waschflüssigkeit im Reaktionsloch sollte während des Waschvorgangs auf dem Absorptionspapier getrocknet werden, das Absorptionspapier nicht direkt in das Reaktionsloch gelegt werden soll, während die restliche Flüssigkeit und die Fingerabdrücke auf der Platte vorsichtig gelöscht werden müssen, um zu vermeiden, dass die endgültige enzymatische Messung beeinflusst wird. Wenn Sie eine automatische Spülmaschine verwenden, verwenden Sie sie nach einer erfahrenen Verwendung im Rahmen eines formellen Experiments.

5. Kontrolle der Reaktionszeit: Bitte beobachten Sie nach dem Zugabe des Substrats regelmäßig die Farbänderung des Reaktionsloches, wenn die Farbe dunkler beobachtet wird, fügen Sie die Endflüssigkeit im Voraus hinzu, um die Reaktion zu beenden, um zu vermeiden, dass die Reaktion zu stark ist und die Lichtdichtelesung des Enzym-Skalierers beeinflusst.

6. Substrat: Bitte bewahren Sie den Substrat vor Licht und vermeiden Sie die direkte Beleuchtung durch starkes Licht während der Lagerung und der Wärme.