Leica Laserkonfokusmikroskop

Das Leica Laserkofokusmikroskop TCS SP8 DLS vereint die Vorteile beider Bildgebungssysteme: Mit dem Leica TCS SP8 DLS (Digital Optics) können Sie mit einer weichen einflächigen Beleuchtung auf dem Mikroskop kofokusieren. Durch die Entwicklung des TwinFlect-Spiegels haben wir die Kofokussplattform Leica TCS SP8 in ein einfach zu bedienendes, vielseitiges optisches Mikroskop verwandelt.

Leica Laserkofokusmikroskope (wie Leica SP8, Stellaris-Serie) sind ein hochauflösendes 3D-Bildgebungssystem, das weit verbreitet in der Biomedizin, Materialwissenschaften und anderen Bereichen eingesetzt wird. Die Bedienung erfordert eine Kombination von Optik, Lasersteuerung und Bildverarbeitungstechnik. Im Folgenden finden Sie eine detaillierte Bedienungsanleitung:

1. Vorbereitung vor der Operation

1. Umwelt- und Ausrüstungsprüfung

Umweltanforderungen:

Separate Dunkelkammer oder verdunkelte Umgebung, um zu vermeiden, dass äußeres Licht das Fluoreszenzsignal stört.

Temperaturregelung von 20-25 ° C, Luftfeuchtigkeit ≤ 60%, um die Exposition der Linse oder einen Schaltungsausfall zu verhindern.

Ausrüstungsprüfung:

Stellen Sie sicher, dass die Zustandsanzeige des Lasers (z. B. 405nm, 488nm, 561nm, 633nm) normal ist (grün ist bereit).

Überprüfen Sie, ob das Objektiv (z. B. 10x/0,3, 20x/0,75, 63x/1,4 Ölspiegel) sauber ist und sich der Trägerstand reibungslos bewegt.

Schalten Sie das Kühlsystem ein (z. B. den Laser-Wasserkühler), um sicherzustellen, dass die Temperatur bei den eingestellten Werten (normalerweise 18-22 ° C) stabil ist.

2. Probenvorbereitung

Biologische Proben:

Lebende Zellen müssen in einer kofokusierten speziellen Petrischale (wie Lab-Tek II) kultiviert werden, um die Verwendung normaler Gläser zu vermeiden, die zu fokussierenden Schwierigkeiten führen.

Fixiertes Gewebe-Schnitte benötigen eine Dichtung mit einer Anti-Fluoreszenz-Auslöschtablette (z. B. ProLong Gold) mit einer Dicke von ≤ 20 μm.

Materialproben:

Die undurchsichtigen Proben müssen bis zu einer Oberflächenrauhe Ra < 0,1 μm poliert werden und die transparenten Proben (z. B. Polymere) müssen spontane Fluoreszenzstörungen vermeiden.

Kennzeichnung Anforderungen:

Fluoreszenzfarbstoffe müssen mit Laserwellenlängen übereinstimmen (z. B. DAPI mit 405 nm und Alexa Fluor 488 mit 488 nm).

Wenn Sie mehrfarbig markieren, stellen Sie sicher, dass das Farbstoffemittierungsspektrum nicht überlappt wird (das Signal kann durch die Funktion der Spektralteilung getrennt werden).

2. Grundlegende Betriebsprozesse

1. Start und Initialisierung

Startreihenfolge:

Schalten Sie die gesamte Stromversorgung → 2. Starten Sie das Laserkühlsystem → 3. Öffnen Sie den Mikroskop-Host → 4. Starten Sie die Steuerungssoftware wie LAS X oder Stellaris Suite.

Software Selbstprüfung:

Die Software erkennt automatisch Module wie Laser, Scankopf, Trägerständer und bestätigt den Status als „Ready“.

Führen Sie die Funktion „Daily Check“ aus, um den Lichtweg zu kalibrieren und die Empfindlichkeit des Systems (z. B. PMT-Gewinn, Laserleistung) zu erkennen.

2. Positionierung und Fokussierung der Probe

Niedriger Spiegel Vorschau:

Wählen Sie einen 10x-Luftspiegel aus, schalten Sie den Laser aus und verwenden Sie durchlässiges Licht, wie eine Halogenlampe, um den Probenbereich schnell zu lokalisieren.

Bewegen Sie sich über den XY-Knopf oder die Software-Navigationsfunktion zur Zielposition.

Gemeinsame Fokussierung:

Schalten Sie den 488nm-Laser ein (niedrige Leistung, z. B. 5%) und wählen Sie den "Live"-Modus, um in Echtzeit zu beobachten.

Verstellen Sie den Z-Achsen-Schrittmotor und konzentrieren Sie sich schrittweise mit dem Werkzeug "Fine Focus", bis das Fluoreszenzsignal stark ist.

Wenn Sie auf ein höheres Objektiv (z. B. ein 63x-Ölspiegel) wechseln, müssen Sie ein spezielles Eintauchöl (z. B. Typ F-Öl) zwischen dem Objektiv und dem Deckel tropfen.

3. Einstellungen der Bilderfassungsparameter

Laserleistung und PMT-Gewinn:

Laserleistung: zunehmen allmählich ab 1%, um Lichtbleichung zu vermeiden (in der Regel nicht mehr als 20%).

PMT-Gewinn: Passen Sie die Signalstärke zwischen 100 und 800 (12-Bit-Bild) an, um Sättigung (> 4095) zu vermeiden.

Scanparameter:

Auflösung: Wählen Sie je nach Bedarf 512 x 512 (Schnellvorschau) oder 2048 x 2048 (hochpräzise Bildgebung).

Scangeschwindigkeit: Durchschnittliche Linienfrequenzen 1-4 mal (erhöht bei hohem Rauschen) und durchschnittliche Bildfrequenzen 1-8 mal (verringert bei dynamischer Bildgebung lebender Zellen).

Nadelbohrungsgröße: Normalerweise auf 1 Airy-Einheit (AU) eingestellt, um die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis auszugleichen.

Spektrumseinstellungen:

Wenn Sie mehrfarbig markieren, scannen Sie das Emissionsspektrum der Probe im Lambda-Scan-Modus und setzen Sie den Wellenlängenbereich ein (z. B. DAPI: 410-480 nm, Alexa Fluor 488: 500-550 nm).

3D-Bildgebung und Zeitreihen

Z-Achse Stapel:

Wenn Sie die Start-/Endposition und den Schritt (z. B. 0,5 μm) festlegen, fotografiert die Software automatisch mehrere Schichten und synthetisiert ein 3D-Modell.

Zeitreihe:

Bei der Bildgebung lebender Zellen werden Zeitintervalle (z. B. 1 Bild pro 30 Sekunden) und die Gesamtzahl von Bildern (z. B. 100 Bildern) festgelegt, um den dynamischen Prozess aufzuzeichnen.

Aktivieren Sie die Funktion „Autofokus“, um den Fokus stabil zu halten und zu verhindern, dass Zellbewegungen zu Abfokussierung führen.

Funktionsanwendungen des Leica Laser Co-Focus Mikroskops

Lichtblatt (Light Sheet)

Geeignet für die schnelle Bildgebung mit niedriger Lichttoxizität für dicke Proben wie Zebrafisch-Embryonen.

Betriebsschritte:

Wechseln Sie auf das Lichtmodul, um die Lichtdicke (normalerweise 2-5 μm) anzupassen.

Stellen Sie die synchrone Erfassung mit zwei Kameras ein (z. B. Lichtdurchlässigkeit und Fluoreszenzsignale).

Mit der Funktion „Multi-View“ können Sie mehrwinkliche Bilder verbinden und dreidimensionale Strukturen rekonstruieren.

Ultraauflösende Bildgebung (z.B. STED)

Durchbrechen Sie die Diffraktionsgrenzen mit einer Auflösung von 20-50 nm.

Betriebspunkte:

Verwenden Sie spezielle STED-Objektive (z. B. 100x/1,4-Ölglase) und Erschöpfungslaser (z. B. 592 nm).

Passen Sie die Laserleistung (in der Regel 50-200mW) und den Phasenmaskenmodus (wie 2D oder 3D STED) an.

Nach der Erfassung wird die Anti-Konvolution mit der Software "Huygens" oder "Thunder" durchgeführt.

3. Spektrale Spaltung und lineare Dekonvolution

Überlappende Signale bei mehrfarbigen Markierungen trennen:

Erhalten Sie die Emissionsspektrumbibliothek im Lambda-Scan-Modus.

Spektrale Daten werden im Werkzeug „Spectral Unmixing“ geladen und die Software berechnet automatisch das reine Signal jedes Kanals.

Ändern Sie die Schwelle, um Hintergrundgeräusche zu entfernen und das aufgeteilte Bild zu speichern.

4. Wartung und Wartung

1. Tägliche Reinigung

Optische Komponenten:

Entfernen Sie Objektive, Filteroberflächenstaub mit einem Blasballon, deaktivieren Sie Baumwollstacke oder Papiertücher direkt.

Zur Reinigung tauchen Sie eine kleine Menge Ethanol (oder spezielle Reinigungsflüssigkeit) mit Objektivpapier ein und reiben Sie es spiralförmig.

Laststelle und Probenlager:

Mit einem antistatischen Tuch abwischen, um Rückstände von Öl oder Dichtungsmitteln zu vermeiden.

2. Laserwartung

Einschränkungen:

Arbeiten Sie nicht länger als 8 Stunden, um Schäden an der Überhitzung des Laserrohrs zu vermeiden.

Reduzieren Sie die Laserleistung zuerst auf 1% und schalten Sie den Laserschalter aus.

Überwachung der Lebensdauer:

Überprüfen Sie die verbleibende Lebensdauer in der Schnittstelle "Laser Status" der Software (z. B. 488 nm Laser in der Regel ≥ 20.000 Stunden).

Wenn Sie sich dem Ende der Lebensdauer nähern, wenden Sie sich im Voraus an Leica, um das Laserrohr zu ersetzen.

3. Regelmäßige Kalibrierung

Lichtwegkalibrierung:

Die Ausrichtung der Achsen und der Nadeln wird vierteljährlich mit einer Standard-Fluoreszenzmikrokugel wie TetraSpeck kalibriert.

Mechanische Kalibrierung:

Prüfen Sie jährlich die Genauigkeit der XY-/Z-Achse der Tragstelle (der Fehler sollte < 0,1 μm) und passen Sie bei Bedarf die Schrittmotor-Parameter an.

5. Lösung häufiger Probleme

Bild ohne Signal

Überprüfen Sie, ob der Laser eingeschaltet ist, ob der PMT-Verstärkung > 0 ist und ob der Filter übereinstimmt (z. B. der emittierende Filter blockiert das Signal nicht).

Verschwommenes Bild

Vergewissern Sie sich, ob das Objektiv ausreichend in Öl eingedrungen ist, ob die Nadellöcher verschoben sind und ob die Probe flach ist (z. B. eine lebende Zellenabsprungung führt zu einer Abfokussierung).

Unstabile Laserleistung

Reinigen Sie das Laserausgangsfenster und prüfen Sie, ob die Wassertemperatur des Kühlsystems im eingestellten Bereich liegt (z. B. ± 0,5 °C).

Software Karton

Schließen Sie andere große Programme, verlangsamen Sie die Bildauflösung oder Scangeschwindigkeit oder erhöhen Sie den Computerspeicher (≥32 GB empfohlen).

6. Leica Laser Kofokussmikroskop Sicherheitshinweise

Lasersicherheit:

Tragen Sie beim Betrieb eine Laserschutzbrille (Wellenlängen müssen alle verwendeten Laserstrahlen abdecken).

Es ist verboten, einen direkten Laserstrahl oder reflektiertes Licht zu betrachten, um eine lange Exposition der Haut einem leistungsstarken Laser (z. B. > 50 mW) zu vermeiden.

Biologische Sicherheit:

Bei der Behandlung von lebenden Zellen oder Krankheitserregern in einem Biosicherheitsschrank, um eine Verschmutzung der Probe zu verhindern.

Chemische Sicherheit:

Wenn Sie mit organischen Lösungsmitteln wie Ethanol reinigen, arbeiten Sie im Ventilationsschrank und vermeiden Sie das Einatmen von flüchtigen Gasen.