Hochdurchflussdifferentielles Scannfluorescenzometer SUPR-DSF

Proteinstabilität

Die Proteinstabilität ist eine der wichtigsten Qualitätseigenschaften von biotechnologischen Arzneimitteln und bestimmt die Wirksamkeit, die Herstellungsfähigkeit, die Sicherheit und die Haltbarkeit von Arzneimitteln. Die hohe strukturelle Stabilität des Proteins gewährleistet, dass das Protein während seiner Haltbarkeitsdauer aktiv und sicher bleibt.

Stabilitätsstudien werden verwendet, um die Stabilität der HOS (High Order Structure) eines Proteins unter verschiedenen Bedingungen wie Temperatur, pH, Zusatzbestandteile und Lagerzeit zu bestätigen, um geeignete Lager- und Transportbedingungen zu bestimmen. Zudem verlangen Regulierungsbehörden wie FDA, EMA usw. umfangreiche Stabilitätsdaten, bevor sie die Genehmigung für die Verwendung von Biomedikamenten erteilen. Daher ist das Verständnis und die Gewährleistung der fortgeschrittenen strukturellen Stabilität von therapeutischen Proteinmedikamenten eine notwendige Voraussetzung für die Entwicklung sicherer und wirksamer Arzneimittel durch biopharmazeutische Unternehmen, und Forscher müssen die fortgeschrittene strukturelle Stabilität von Proteinen in mehreren Phasen der Forschung, Entwicklung und Produktion analysieren und bewerten.

Analysemethoden zur Proteinstabilität

Die Stabilitätsanalyse von Proteinen wird in der Regel mit folgenden Methoden untersucht:

Biochemische Methoden

CD (Circular Dichroism Spectroscopy, Kreisdichroismus-Spektroskopie)

Differenzielle Scanthermie (DSC)

Quantitative PCR (qPCR) Technologie (exone Fluoreszenz DSF)

Dynamische Lichtstreuung (DLS) und statische Lichtstreuung (SLS)

Die Differential Scan Quantity Thermometer (DSC) Methode wird oft als die wichtigste Lösung für die Proteinstabilitätsanalyse angesehen, jedoch ist die Anwendung von DSC in der Medikamentescreening und der frühen Entwicklung eingeschränkt durch die schnelle Analyse von großen Mengen an Proben, die auf Mikroporenplatten wie 96- oder 384-Bohrplatten gespeichert sind. Daher ist die DSF (endogene Fluoreszenzmethode) zu einer beliebten und kostengünstigen Lösung geworden.

Die DSF (endogene Fluoreszenzmethode) ermöglicht die schnelle Messung der gesamten Mikroporenplatte der Probe ohne Kennzeichnung der Probe oder Verwendung einer Fluoreszenzsonde und liefert hohe Durchflussdaten zur Unterstützung bei der Untersuchung von Probenkandidaten und Rezeptbestandteilen.

Die DSF-Methode hat eine große Anzahl von Proben schnell gescreent, was die Effizienz des Drogenscreenings und der pharmazeutischen Analyse erheblich verbessert hat, und die Analyseresultate werden mit der DSC-Technologie überprüft. Für viele biotechnologische Arzneimittel ist die Verwendung der DSF-Methode als schnelles, massenhaftes Screening und die Verwendung der DSC-Technologie zur orthogonalen Validierung der frühen Screening-Ergebnisse von DSF ein effektives Programm für Drogenscreening und Drogenentwicklung.

Technische Grundsätze von DSF:

Die Differential Scanning Fluorescence Methode (DSF) ist eine kostengünstige und benutzerfreundliche biophysikalische Technik, die die Transformationstemperatur eines Proteins bestimmt (thermische Transformationstemperatur Tm oder chemische Transformation Cm), indem sie entsprechende Veränderungen im Fluoreszenz-Emissionsspektrum erkennt, wenn die Temperatur steigt oder ein Degradationsmittel vorhanden ist.

Die Studie ergab, dass die aromatischen Ringaminosäuren in Proteinmolekülen in einer Mikroumgebung mit unterschiedlicher Polarität (z. B. in einer hydrophoben oder hydrophilen Umgebung) das maximale Emissionsspektrum ihrer angeregten endogenen Fluoreszenz verschieben. Die endogene Fluoreszenz in Proteinen stammt hauptsächlich von aromatischen Ringaminosäuren wie Triamin (Trp), Phenylalanin (Phe) und Tyrin (Tyr), bei denen Triamin eine starke endogene Fluoreszenz hat.

Zum Beispiel liegt die maximale emittierende Wellenlänge der endogenen Fluoreszenz in der proteinhydrophoben Kernel-Mikroumgebung bei etwa 330 nm, während die maximale emittierende Wellenlänge der endogenen Fluoreszenz in der hydrophilen polaren Mikroumgebung bei etwa 350 nm liegt. Die thermische oder chemische Degradation von Proteinen führt in der Regel zu einer Veränderung der Polarität der Mikroumgebung rund um die Tränin-Reste, so dass die Tränin, die in der Regel in einem proteinhydrophoben Kern begraben ist, allmählich einer hydrophilen Umgebung ausgesetzt ist, was zu einer Rotverschiebung der maximalen emittierenden Wellenlänge der endogenen Fluoreszenz führt (Red Shift), d.h. in einen größeren Wellenlängenbereich.

Diese Methode zur Überwachung der endogenen Fluoreszenzveränderungen von Tragen erfordert keine Fluoreszenzsonde oder ein Etikett und verhindert falsche positive Ergebnisse wie Hintergrundfluoreszenz und unspezifische Adsorption in herkömmlichen exogenen Fluoreszenz-DSFs.

Wenn sich ein Protein aufgrund thermischer Degradation oder chemischer Degradationsmittel (z. B. Gwandin, Harnstoff usw.) entfaltet, kann die Messung der endogenen Fluoreszenz mit Temperatur- oder Degradationsmitteländerungen die Entfaltung des Proteins untersuchen. Die Daten dieser Veränderungen können verwendet werden, um Schmelzkurven zu erzeugen und den Wert der scheinbaren thermischen Transformationstemperatur Tm zu erhalten, Tonset、 Van der Hahn-Entalphie (ΔH), Gibbs-freie Energie (ΔG), Cm-Werte chemischer Degradation usw. werden zur Beurteilung und Prognose der Proteinstabilität verwendet.

Traditionelle DSF verwendet häufig 350/330-Verhältnis für die Datenanalyse, während SUPR-DSF bietet eine Vielzahl von Analysemethoden, zusätzlich zu den Verhältnissen, bietet SUPR-DSF auch BCM (Barycentric mean, Massenmittel), kann ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als 350/330-Verhältnis erhalten und zugleich günstiger für die Analyse von Proteinproben mit niedrigen Konzentrationen.

Hochdurchflussdifferentielles Scannfluorescenzometer SUPR-DSFHauptmerkmale des Systems:

Standardplatte mit 384 Mikroporen ohne spezielle Verbrauchsmaterialien und Kapillaren

Hochdurchflusssiegerung, innerhalb eines Erwärmungsprozesses (60-80 Minuten)

Test einer 384-Mikroporenplatte mit endogener Fluoreszenz, ohne Farbstoff oder Etikett, kompatibel mit gängiger Biosystem-UV-LED-Anregung mit Vollspektrumprüfung

Nur 10-30 μl Probe erforderlich, Probenkonzentration 0,05 ~ 250mg / mL

Schlüsselparameter erhalten: Tonset, Tm, ΔΗ, ΔG, Cm und Affinität usw.

Bereitstellung strenger Datenqualität und Wiederholbarkeit

Hochdurchflussdifferentielles Scannfluorescenzometer SUPR-DSFAnwendungen des Systems:

Das SUPR-DSF-System wird in vielen Bereichen wie der Grundlagenforschung in den Lebenswissenschaften und der Arzneimittelentwicklung eingesetzt:

Beschleunigte Screening von Mutanten

Screening und Optimierung von Rezepten und Vorrezepten

Protein Kristallisation Bedingungen Screening

Konsistenzbewertung zwischen den Chargen

Bioähnlichkeitsbewertung

Beschleunigte Stress- und Zwangsabbaufforschung

Analyse in Kombination mit induzierten Konfigurationsveränderungen

Bewertung der Änderungen nach der Übersetzung

Thermostatische und chemische Stabilitätsanalyse

Technische Spezifikationen des SUPR-DSF Systems:

Typische Anwendungsfälle -Beschleunigte Screening von Mutanten

Mit SUPR-DSF wurden 16 Proben verglichen und gescreent, darunter 1 Wildtyp-Protein (WT) und 15 Einzelpunktmutationen. Innerhalb von 1,5 Stunden erzeugte das DSF-Instrument eine hochwertige Schmelzkurve von 48 Proben (jeweils 3 Wiederholungen) (Daten von bis zu 384 Löchern können während des gleichen Zeitraums erzeugt werden). Die Daten werden mit dem Modell angepasst, um den Schmelztemperaturwert Tm zu erfassen und die Stabilität zu sortieren und zu filtern.

Wie in Abbildung 1 gezeigt, verschoben sich die Schmelzkurve von drei Mutanten (9, 13 und 14) nach links im Vergleich zu WT (blau), was auf eine verminderte Proteinstabilität hinweist; Die Stabilität der übrigen 12 Mutanten wurde verbessert. Die Stabilität der Mutanten 1, 8 und 12 ist am stärksten erhöht.

Abbildung 2 zeigt die Schmelzkurve mehrerer repräsentativer Proben, wobei einige Proteine einen einzigen thermischen Transformationsprozess aufweisen (WT-Protein mit Mutanten 7 und 8), während andere Proteine (Mutanten 1 und 14) eindeutig zwei Phasen des thermischen Transformationsprozesses zeigen, nämlich zwei Wendepunkte auf der Schmelzkurve. Die Daten, die durch SUPR-DSF bereitgestellt werden, können Forschern helfen, vielversprechende Kandidaten für eine gründliche Untersuchung zu wählen.

Präzise Analyse des Fab-Bereichs

Verwenden Sie SUPR-DSF, um Differential Scan Fluoreszenzdaten von NISTmAb (NIST Monovalent) zu erhalten und die Ergebnisse mit den Daten der Differential Scan Quantitative Thermometer (DSC) zu vergleichen. SUPR-DSF kann alle drei Strukturdomäne von NISTmAb analysieren: CH2 (69 °C), CH3 (83 °C) und Fab-Zone (94 °C). Mit einer maximalen Scantemperatur von 105 °C kann die Schmelztemperatur der ungewöhnlich stabilen Fab-Zone genau gemessen werden, während die Scan-Maximaltemperatur für andere DSF-Plattformen in der Regel nur 95 °C beträgt, was wichtige Informationen über die Defaltung der monoresistenten Fab-Zone leicht verliert (Abbildung 5(a)).

Die normalisierten SUPR-DSF-Daten werden mit den DSC-Ergebnissen verglichen. Wie in Abbildung 5(b) gezeigt, passen die drei Spitzen zueinander, was eine gute Konsistenz der beiden Techniken beweist, und mit SUPR-DSF können qualitativ hochwertige Proteinstabilitätsinformationen leicht erhalten werden.

Typische Anwendungsfälle - Zubehör- und Rezeptscreening für Accelerated Turbozumab

Rezepte für Biotherapeutische Medikamente wie Antikörper sind die Grundlage für Wirksamkeit, Herstellungsfähigkeit und Sicherheit und bestimmen auch die Lager- und Transportbedingungen. Pharmaunternehmen benötigen dringend eine Methode mit hohem Durchsatz, um eine große Anzahl von Bedingungen schnell und zuverlässig zu screenen, um die optimale Rezeptur zu bestimmen.

Mit SUPR-DSF screenten und analysierten die Forscher die Stabilität des therapeutischen Antikörpers Trotuzumab unter 96 verschiedenen Bedingungen und beendeten den Test innerhalb von 1,5 Stunden. Die Testergebnisse sind sehr konsistent mit den Ergebnissen der Differential Scan Quantity Thermometer (DSC). Durch die Integration von Laborautomatisierungsgeräten können täglich Tausende von Proben untersucht werden.

Die DSF-Schmelzkurve zeigt zwei unabhängige Transformationsbereiche, die durch eine Minimum-Zwei-Vielfachung an die Daten angepasst werden, um Tonset-Werte, Tm-Werte und Van der Waasser-Entalphie (DieDie Die Die Die Die H) zu bestimmen. Abbildung 3(a, b) zeigt die Schmelzkurven und die Fitting-Diagramme für die Störung/Stabilitätssteigerung von Zusatzstoffen. Abbildung 4(a) zeigt alle Zusatzstoffe, die die Stabilität von Antikörpern verbessern können (im Vergleich zur Kontrollprobe).

SUPR-DSF identifizierte korrekt die stabilisierende Wirkung der Zusatzstoffe Histonin und Algasys, die in dem bereits auf dem Markt aufgeführten Tracurumab verwendet werden, und wie in Abbildung 4(b) gezeigt, bieten die SUPRDSF-Daten eine hervorragende Zuverlässigkeit und Konsistenz, während sie einen erstaunlich hohen Durchsatz liefern.

Erhalt von Kombinationsparametern mittels High Flow Differential Scanning Fluorescence

Die kombinierte analytische Forschung ist ein Schlüsselbereich der Arzneimittelentwicklung, wo die Charakteristik der Wechselwirkungen und der KD-Wert (die Konstante des Dissonationsgleichgewichts, die Affinität der intermolekularen Bindungen charakterisiert) für die Auswahl der Kandidaten entscheidend sind, und Forscher müssen eine Reihe von prinzipiell komplementären Ansätzen anwenden, um Tausende bis Zehntausende von kleinen molekularen Verbindungen in der Bibliothek zu screenen und zu identifizieren.

Eine molekulare Wechselwirkungsanalyse mit SUPR-DSF, die nicht von Faktoren wie Oberflächeneffekten, Massentransport oder Pufferbrechungsratenproblemen beeinflusst wird, ermöglicht eine hohe Durchfluss- und markierungslose Messung im Bereich der Analytikbindungskonzentrationen.

Durch die Erkennung von Stabilitätsänderungen des Protein-Ligand-Komplexes kann verwendet werden, um die Spezifizität der Bindung zu bestätigen; Durch die Änderung des Fluoreszenz-Emissionsspektrums bei thermischer Degradation und die funktionelle Beziehung der Ligandkonzentration können KD-Werte berechnet werden. Selbst bei sehr schwachen Bindungsmolekülen können durch die Bindung induzierte Stabilitätsänderungen durch SUPR-DSF nachgewiesen werden.

Mit einer Standard-384-Mikroporenplatte kann die Stabilität von Tausenden von Proben an einem Tag gesehen werden, um den Bindungszustand zu bestätigen.

Mit der Kombination von SUPR-DSF-Studienliganden (TFMSA) mit Human Carbohydrase I ändert sich die Schmelzkurve der Carbohydrase mit der TFMSA-Konzentration wie in Abbildung 6 dargestellt.

Abbildung 7 zeigt die Beziehung zwischen dem Tm-Wert der menschlichen Carbonanhydridase I und der TFMSA-Konzentration, die zwei erhaltenen KD-Werte von 2,1 μM und 174,2 μM entspricht, und

Konsistente Zahlen in der Literatur zeigen, dass SUPR-DSF als Pre-Screening- oder Bestätigungswerkzeug für Ligand-Bindungsstudien verwendet werden kann und empfindlich ist.

Intuitive und einfache Software

Die SUPR-DSF-Software bietet intuitive, einfache, intelligente und effiziente Funktionen für das Design von Experimenten und die Datenanalyse, die sowohl Anfängern als auch erfahrenen und erfahrenen Anwendern eine Vielzahl von erweiterten Optionen ermöglichen.

Über ProteinStable

Eine Tochtergesellschaft von Applied Photophysics mit dem Ziel, kundenorientierte Technologien auf den Markt für Proteinscreening und Charakterisierung einzuführen, mit Schwerpunkt auf Proteincharakterisierungsmethoden mit hohem Durchsatz und geringem Probenvolumen, die die Produktivität steigern, ohne die Datenqualität zu beeinträchtigen.

Über AppliedPhotophysics

Applied Photophysics, ein britisches Unternehmen für angewandte Photophysik, bietet seit Jahrzehnten spezialisierte Lösungen für die Struktur- und Funktionsforschung von Biomedikamenten, darunter runde bifarbige CD-Spektrometer, Stopped Flow-Reaktionsdynamikanalysatoren und SUPR DSF-Proteinstabilitätsanalysatoren.

Warten Sie. Nutzer sind an Universitäten und Forschungseinrichtungen sowie Pharmaunternehmen weltweit vertreten.

Die Chirascan-Serie von runden bifarbigen CD-Spektrometern ist weit verbreitet in der fortgeschrittenen strukturellen Charakterisierung von Biomedikamenten wie Proteinen, einschließlich der sekundären Struktur von Proteinen, der tertiären Strukturanalyse und der Thermostabilitätsstudie der sekundären Struktur und der tertiären Struktur.