Fluo-8 AM, Cell Permeant Kalzium-Ionen-Fluoreszenzsonde

Fluo-8 AM, Cell Permeant Kalzium-Ionen-Fluoreszenzsonde

Produktbeschreibung

Fluo-8（Fluo-2 Medium Affinity）， Es ist derzeit die hellste sichtbare Licht-excitierende Wellenlänge Ca2 + Fluoreszenzsonde, die doppelt so stark ist wie Fluo-4 und viermal so stark ist wie Fluo-3. Fluo-8 hat eine mittlere Ca2+-Affinität, nahezu Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM）， Fast identisch mit Fluo-3 und Fluo-4. Fluo-8 behält nicht nur die spektralen Erkennungseigenschaften von Fluo-3, Fluo-4 mit einer maximalen Anregungswellenlänge von 490 nm und einer maximalen Emissionswellenlänge von 514 nm nach der Kombination mit Ca2 +. Außerdem verfügt es über eine verbesserte Zelllast und eine Ca2 +-Reaktionsfähigkeit. Fluo-8 Lader hat eine schwache Temperaturabhängigkeit und Inkubierung bei Raumtemperatur oder 37 ° C ist gut gefärbt, im Gegensatz zu Fluo-3, Fluo-4 ist streng erforderlich, um bei 37 ° C zu inkubieren, diese Eigenschaft macht es besser geeignet für HTS-Hochdurchfluss-Screening-Experimente. Fluo-8 ist weit verbreitet und mit vielen Zelllinien und Zielproben kompatibel und wird nicht durch das Signalisieren von Liganden oder Zielen selbst gestört.

Fluo-8 kann Veränderungen des intrazellulären Kalziumionenspiegels durch Laser-Kofokussmikroskop, Strömungszellometer, Fluoreszentase-Calibrator, Fluoreszenzmikroskop usw. erkennen. Fluo-8, AM ist ein Acetylmethylester-Derivat von Fluo-8, das die Zellmembran durchdringt und einfach in die Zellen gelangt, indem es einfach kultiviert wird. Sobald es in die Zelle gelangt, wird es durch die Endoesterase geschnitten, um ein nicht membraninfiltrierendes Fluo-8 zu erzeugen, das in der Zelle bleibt, um die entsprechende physiologische Funktion zu erfüllen.

Dieses Produkt ist in Form von 50 µg kleiner Verpackung gefriertrocknetes Pulver, empfohlene Konzentration 1-5uM für die Erkennung von Ca2 + in der Zelle.

Fluo-8 AM, Cell Permeant Kalzium-Ionen-Fluoreszenzsonde

Grundeigenschaften

SynonymeFluo-8, AM

Molekuläre Formelvon: C50H50N2O23

Molekulargewicht：1046.9316

LöslichkeitLösung in DMSO (1-5 mM)

Ex/Em490/514 nm (Ca2+ Bindung)

LagerbedingungenBei -20 ° C trocken aufbewahren, 1-jährige Gültigkeitsdauer.

Fluo-8 AM, Cell Permeant Kalzium-Ionen-Fluoreszenzsonde

Gebrauchsanweisung

A Reagenzbereitung

1) Zubereitung der Pluronic F-127-Mutterlösung: 500 µl DMSO in 100 mg Pluronic F-127-Pulver (Cat-Nr. FS0432) und 20 % (W/V) Mutterlösung zuzusetzen. Der Auflösungsprozess muss 20-30min bei 40-50 ° C erhitzt werden. Die Lösung wird bei Raumtemperatur aufbewahrt und muss nicht gekühlt werden. Wenn die Kristallisation entsteht, kann die Lösung erneut erhitzt werden, ohne die Verwendung zu beeinträchtigen.

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3) Oder andere physiologische Puffer

B Betriebsschritte

1) Lösen Sie Fluo-8 mit wasserlosem DMSO, AM zu einer 1-5mM-Speicherflüssigkeit oder entfernen Sie die bereits ausgerüstete Fluo-8, AM-Speicherflüssigkeit bei Raumtemperatur. (Zum Beispiel: Wenn Sie eine 4 mM Mutterflüssigkeit herstellen, müssen Sie 11,9 ul wasserloses DMSO zu 50 µg Fluo-8, AM hinzufügen).

2) Mit HHBS oder einem anderen physiologischen Puffer Fluo-8, AM + DMSO Speicherflüssigkeit auf 1-10 uM verdünnen und eine angemessene Menge 20% Pluronic F-127-Lösung im Voraus hinzufügen, so dass die Endkonzentration 0,02% beträgt.

Anmerkung (1): Die empfohlene Belastungskonzentration von Fluo-8, AM für die Anwendung in den meisten Zellen beträgt 4-5 uM, die spezifische Anwendungskonzentration muss nach den experimentellen Anforderungen optimiert werden. Um zu vermeiden, dass eine Überbelastung zur Zytotoxizität führt, wird empfohlen, eine möglichst niedrige Zui-Sondenkonzentration auf der Grundlage der erzielten Ergebnisse zu verwenden.

[Hinweis (2)]: Fluo-8, AM Arbeitsflüssigkeit muss jetzt verwendet werden, um wiederholte Gefrierungen zu vermeiden.

[Hinweis (3)]: Pluronic F-127 verhindert die Polymerierung von Fluo-8,AM in der Lösung und fördert die Sonde besser in die Zelle zu gelangen. Pluronic F-127 verringert jedoch die Stabilität von Fluo-8, AM, daher wird es nur empfohlen, sie bei der Herstellung von Arbeitsflüssigkeiten hinzuzufügen, und es wird nicht empfohlen, die Speicherflüssigkeit für eine langfristige Aufbewahrung hinzuzufügen.

3) [Optional] Wenn die Zelle einen organischen Aniontransporter, Probenecid (1-2,5 mM) oder Sulfinpyrazon (0,1-0,25 mM) enthält, kann es erforderlich sein, das Zellkulturmedium hinzuzufügen, um die Leckage der Deesterierungssonde zu verringern.

[Anmerkung (1)]: Propylsulfon- oder Sulphyridon-Speicherflüssigkeit ist ziemlich alkalisch, daher muss der pH-Wert nach Zugabe des Mediums neu angepasst werden.

4) Fügen Sie die vorbereitete Fluo-8, AM Arbeitsflüssigkeit in die Zelle hinzu, die Menge ist abhängig von der Abdeckung der Zelle. Inkubieren Sie bei 37 ° C oder Raumtemperatur 20-60 min.

Hinweis (1): In Bezug auf die Inkubationszeit, wenn das erste Experiment nicht bestimmt werden kann, wird empfohlen, zuerst 30 Minuten zu inkubieren, um den Fluoreszenzeffekt zu sehen; Wenn die Zellen sterben, die Zeit angemessen zu verkürzen; Wenn die Fluoreszenz-Intensität zu schwach ist, verlängern Sie die Zeit angemessen.

[Anmerkung (2)]: Die Senkung der Sondenlasttemperatur kann die zonale Raumisierung der Sonde verringern.

5) Absaugen Sie die Färbungsflüssigkeit und ersetzen Sie sie durch HHBS oder einen anderen physiologischen Puffer (wenn nötig mit einem Puffer, der ein Transporterinhibitor wie 2,5 mm Propylsäure enthält), um die überschüssige Sonde zu entfernen.

6) Verwenden Sie geeignete Instrumente wie Laserkofokus, Strömungszellometer, Fluorenzysammeter usw. zur Prüfung mit Wellenlänge Ex / Em = 490 / 520 nm.

[Anmerkung (1)]: Fluo-8, AM nach Eintritt in die Zelle, wird durch Esterase Abbau zu Fluo-8 gebildet und bleibt nicht im Zytoplasma in Form von Supply-Price-Bindung. Daher können keine lebenden Zellen mit Farbstoffen festgehalten werden, um Ca2 + -Spiegel zu prüfen.

Hinweise

1) Fluoreszenzfarbstoffe gleichmäßig im Problem des Auslöschens, bitte achten Sie möglichst darauf, Licht zu vermeiden, um das Auslöschen der Fluoreszenz zu verlangsamen.

2) Acetyloxymethylester (AM) leicht Feuchtigkeit zu saugen, nach dem Entfernen des Kühlschranks bitte in einer trockenen Umgebung auf Raumtemperatur nach dem Öffnen. Aufgrund der Spurenmenge des Reagents wird es kurz vor dem Öffnen zentrifugiert, um sicherzustellen, dass das Pulver in den Rohrboden fällt.

3) Fluo-8, AM wird bei 4 ° C, Eisbad und anderen niedrigeren Temperaturen kondensiert und an dem Zentrifugerrohrboden oder der Rohrwand oder dem Rohrdeckel festkleben, kann bei 20-25 ° C für einen Moment verwendet werden, bis es vollständig gelöst ist.

4) Fluo-8, AM zum ersten Mal verwendet, wird empfohlen, die Speicherflüssigkeit zu verwenden, die in eine einzige Dosis aufgeteilt ist, um streng ≤ -20 ° C zu versiegeln und zu trocknen, um Feuchtigkeit zu verhindern. Um ein gutes Experimentergebnis zu gewährleisten, sollten Sie es möglichst kurz verwenden.

5) Aus Gründen Ihrer Sicherheit und Gesundheit tragen Sie bitte experimentelle Anzüge und Einweg-Handschuhe.