Vorbehandlung der Probe

Instrumentenkonfiguration und Chromatografiebedingungen

Spektrum und Daten

3.1 Trennungsspektrum und Daten für Standardlösungen aus alpha- und beta-Lactoglobin-Mischungen

Abbildung 1 Trennungsspektrum und Daten für Standardlösungen aus alpha-Milkoprotein- und beta-Milkoprotein-Mischung (100 μg/ml)(Klicken Sie auf das große Bild)

Wie in Abbildung 1 gezeigt, haben das Alpha-Milkoprotein und das Beta-Milkoprotein eine gute Spitzenform, eine ausgezeichnete Säulenwirkung und eine bessere Trennung als der Standard. α-Milkprotein Retentionszeit von 21,900 min, Asymmetrie-Faktor 0,98, theoretische Anzahl der Türme 321137; B-Lactoglobin B Retentionszeit von 24,747 min, Asymmetriefaktor 1,01, theoretische Plattenzahl 352451; Die Retentionszeit von beta-Lactoglobin A beträgt 25,467 min, der Asymmetriefaktor 1,00, die theoretische Anzahl der Türme 373359. Die Isolationsgrad von α-Milkoprotein und β-Milkoprotein B betrug 17,77 und die Isolationsgrad von β-Milkoprotein B und β-Milkoprotein A betrug 4,33.

3.2 Alpha-Milkoprotein und Beta-Milkoglobin Single Standard-Lösung Positionierung Überlagerung Spektrum

Abbildung 2 Alpha-Milkoprotein und Beta-Milkoprotein Single-Standard-Lösung Positionierungsüberlagerungsspektrum (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Monolineare Positionierungschromatografie und Spektrografie von α-Milkoprotein und β-Milkoprotein, wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigen α-Milkoprotein, β-Milkoprotein B und β-Milkoprotein A charakteristische Absorption bei 200 nm und 279 nm.

3.3 Kontinuierliche Probenauflage von Standardlösungen für alpha-Milkoprotein- und beta-Milkoprotein-Mischungen

Abbildung 3 Spektrum der kontinuierlichen Probenauflage der Standardlösung für eine alpha-Milkoprotein- und beta-Milkoprotein-Mischung (100 μg/ml, n=4) (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Die Standardlösung für eine alpha-Milkoprotein- und beta-Milkoprotein-Mischung (100 μg/ml) wurde vier Mal in Folge probiert, wobei die Retentionszeit und die RSD der Spitzenfläche weniger als 0,3% waren, und die Methode gut reproduzierbar war, und das Trennungsspektrum und die Daten wurden in Abbildung 3 detailliert.

3.4 Spektrum der Überlagerung der Kalibrierkurven für die Standardlösung von α-Milkoprotein und beta-Milkoprotein

Abbildung 4 Spektrum der Überlagerung der Kalibrierkurven der Standardlösung von α-Milkoprotein und β-Milkoprotein (0,00/40,0/80,0/120/160/200 μg/ml) (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Rohmilch und pasteurisierte Milch haben in der Regel hohe Anteile an α-Milkoprotein und β-Lactoglobin, weshalb der lineare Bereich empfohlen wurde, der von den Gruppenkriterien T/TDSTIA 002-2021 und T/TDSTIA 007-2019 empfohlen wird. Wie in Abbildung 4 gezeigt, ist die Standardlösung von α-Milkprotein linear im Bereich von 0,00-200 μg/ml mit linearem Korrelationskoeffizienten r²≥0,9997, linearer Bereich von 0,00-200 μg/ml, linearer Korrelationskoeffizient r²≥ 0,9991, gut linear. Wobei β-Lactoglobin B und β-Lactoglobin A mit Verbindungsgruppen quantifiziert werden.

3.5 Alpha-Milkoprotein und Beta-Milkoprotein-Standardlösung (40,0 μg/ml) und Überlagerungsspektrum der Leerlösung

Abbildung 5 Spektrum der Überlagerung von α-Milkoprotein- und β-Milkoprotein-Standardlösungen (40,0 μg/ml) mit leeren Lösungen (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Bei einem Probenvolumen von 10 uL wurden die Spitzenhöhen von α-Milkoprotein und β-Milkoprotein (40,0 μg/mL) als S ausgewählt, wobei der Durchschnittswert des Matrixgeräuschs von 22,5 bis 24,0 min N war und das Signal-Rausch-Verhältnis von α-Milkoprotein, β-Milkoprotein B und β-Milkoprotein A 523,3, 139,9 und 133,6 betrug, wie in Abbildung 5 gezeigt. Zusammen mit der Optimierung des Probenvolumens kann daher die Empfindlichkeit der alpha- und beta-Lactoglobin-Messmethoden auch die Anforderungen von 1,00 μg/mL in NY/T 4630-2025 erfüllen.

3.6 Spektrum der Überlagerung von Standardlösungen für alpha-Milchprotein- und beta-Milchglobulingemischte mit pasteurisierten Milchprobenlösungen

Abbildung 6 Überlagerungsspektrum der Standardlösung für eine alpha-Milchprotein- und beta-Milchglobulinmischung mit einer pasteurisierten Milchprobenlösung (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Neben dem Whey-Protein enthält die Milch eine hohe Menge an Kasein und anderen Proteinen, die die Messung von α-Milchprotein und beta-Milchglobulin stören können. Nach der Vorbehandlung der pasteurisierten Milchprobe mit pH-Regulierung, Hochgeschwindigkeitszentrifugation usw. bleibt das unveränderte α-Milchprotein und beta-Milchglobulin in der Oberflüssigkeit, deren Isolationsspitzentyp besser ist, die Ausgangslinie glatt ist und der Spitzentyp nicht stört wird, wie in Abbildung 6 gezeigt. Bei der Quantifizierung der pasteurisierten Milchprobe wurden alpha-Milchproteine von 1033,6 mg/kg und beta-Milchglobuline von 2949,0 mg/kg gemessen, was im Wesentlichen den Etikettenwerten entspricht.

3.7 Spektrum und Daten für die Trennung von Pasteurisierter Milch (Hypertemperaturmilch), Hypertemperaturmilch (Normalmilch) und Milchpulverformulierungen für Säuglinge und Kleinkinder

Alpha- und β-Lactoglobin sind temperaturempfindlich, und hohe Temperaturen zerstören ihre chemische Struktur und biologische Aktivität. Wie in Abbildungen 7-9 gezeigt, gibt es keine offensichtlichen Störspitzen in der Nähe von alpha-Milch- und beta-Milchglobulin-Zielspitzen in pasteurisierter Milch (Kryomilch), genaue Bestimmung und Quantifizierung, Rohmilch, pasteurisierte Milch und andere Proben gelten für die Methode 1 NY/T 4630-2025; Ultra-Temperatur-Sterilisierungsmilch (Normal-Temperatur-Milch) und Säuglingsmilchpulver in der Nähe des beta-Lactoglobin-Zielspitzes gibt es offensichtliche Störungsspitzen, die die qualitativen und quantitativen Ergebnisse ernsthaft beeinflussen, das α-Lactoglobin ist relativ klein beeinflusst, Ultra-Temperatur-Sterilisierungsmilch, Säuglingsmilchpulver und andere Proben gelten nicht für die erste Methode NY / T 4630-2025, die zweite Methode wird empfohlen.

3.8 Gel-Penetration-Chromatografie der Standardlösung von alpha-Lactoprotein und beta-Lactoglobin (Methode 2)

Abbildung 10 Gel-Penetration-Chromatografie für die Standardlösung von α-Milkoprotein und β-Lactoglobin (500 mg/L) (Klicken, um das große Bild zu sehen)

Anhand des in der Zeitschrift „China Milch Industry“ veröffentlichten Artikels „Volumenblockierungschromatografie zur Bestimmung des Gehalts an alpha-Milchproteinen in Milch, Milchpulver und Whey“ (2022) wurden zwei MAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7,8 x 300 mm) Volumenblockierungschromatografie-Säulen in Reihe verwendet, die gleichmäßig mit 6 M Hydrochlorid als Flussphase gespült wurden, um alpha-Milchproteine und beta-Milchglobuline bei 280 nm effektiv zu isolieren (wie in Abbildung 10 gezeigt) und 60 Chargen von Milch, Milchpulver und Whey zu testen, um die Anwendbarkeit und Stabilität der Methode zu überprüfen.

Die Spezifikation der MAbPac SEC-17.8×300mm， Die empfohlene Durchflussgeschwindigkeit beträgt 0,5 mL/min, wodurch Lösungsmitteleinsparungen unter Gewährleistung der Trennung erzielt werden können.4.0×300mm Spezifikation für die Chromatografie, empfohlene Durchflussgeschwindigkeit 0,2 mL/min (gegebenenfalls angepasst).

NY/T 4630-2025 Empfehlungen für chromatografische Verbrauchsmaterialien

Referenzen