Vorwort

Antikörper-Kleinmolekular-Drogenkonjugate (ADCs) sind eine Klasse therapeutischer Bioprodukte, die durch Antikörper gezielte Zellen genau identifizieren und die gekoppelten Kleinmolekularen freisetzen können, nachdem sie in die Zielzelle gelangen, um das Ziel der präzisen Tötung von Zielzellen zu erreichen und die Tötung von normalen Zellen zu minimieren. Aufgrund des Designprinzips des ADC wird es als "Biorakete" abgebildet, seit dem ersten ADC-Medikament Mylotarg im Jahr 2000 ® Nachdem Gemtuzumab Ozogamicin von der FDA zugelassen wurde, wurden bis Juni 2025 weltweit 19 ADCs zugelassen. Seit dem ersten weltweiten ADC-Umsatz von zehn Milliarden US-Dollar im Jahr 2023 hat der weltweite ADC-Umsatz im Jahr 2024 weiterhin zehn Milliarden US-Dollar überschritten und ein starkes Wachstum fortgesetzt.

Unter den zehn weltweiten ADC-Verkäufen im Jahr 2024 ist der zweite Platz der von Roche hergestellte KADCYLA. Das Medikament wurde 2013 von der FDA für die Behandlung von HER2-positivem Brustkrebs zugelassen und hat einen weltweiten Umsatz von etwa 2,3 Milliarden US-Dollar im Jahr 2024. Enmigotrumab ist ein ADC, das auf HER2 gerichtet ist und humanes Anti-HER2 IgG1-Tretuzumab enthält, das über den stabilen Schwefelkonektor MCC (4-[N-Malaylamid-methyl]cyclohexan-1-carboxylat) covalent an das mikrotubularsuppressive Medikament DM1 (Methanziderivat) bindet, mit einer Molekulargewichtsverteilung von 147 bis 158 kDa und einem Medikament-zu-Antikörper-Verhältnis (DAR) von 0 bis 8 mit einem durchschnittlichen DAR von etwa 3,5 [3]. Aufgrund der Komplexität seiner Struktur ist seine Charakterisierung eine Herausforderung. In dieser Studie verwenden wir die gerade auf der diesjährigen American Mass Spectrometry Annual Meeting (ASMS) veröffentlichtenDie neue Generation des 2-in-1 Ultrahochauflösenden Massenspektrometers Excedion Pro BiopharmaDie umfassende Charakterisierung von KADCYLA demonstriert die hervorragende analytische Fähigkeit der Plattform im biopharmazeutischen Bereich, insbesondere durch die Funktion der Elektronentransfer/Hochenergiekollisionsdissoziation (EThcD), die zur präzisen Identifizierung von Arzneimittelkopplungsstellen und zur Identifizierung von Post-translationalen Modifikationen (PTM) beiträgt.

Anwendung Highlights

Wie bereits erwähnt, wird das in diesem Jahr neu veröffentlichte 2-in-1-Ultra-High-Resolution-Massenspektrometer der neuen Generation Excedion Pro Biopharma für die detaillierte Charakterisierung von KADCYLA verwendet. Zu den Highlights dieses Instruments zählen, aber nicht beschränkt auf die Erweiterung des Massendetektionsbereichs auf m/z = 12.000 Da (BioPharma-Option erforderlich), die die molekulare Gewichtsmessung von monoklonalen Antikörpern, Monomeren, Dimeren und Trimeren sowie anderen Proteinkomplexen mit großem Molekulargewicht unter nicht degenerierenden Bedingungen erfüllt; Die optionale ETD-Funktion ermöglicht eine schnelle und empfindliche ETD/EThcD-Fraktion in Kombination mit der Higher-energy Collisional Dissociation (HCD), die eine umfassende Abdeckung der Protein-Sequenzen und PTM-Identifikationsinformationen ermöglicht. Die Struktur der Excedion Pro Biopharma-Instrumente ist in Abbildung 1 dargestellt, und Abbildung 2 zeigt den Prozess der eingehenden Charakterisierung von KADCYLA in diesem Experiment.

Abbildung 1: Strukturdiagramm von Excedion Pro BioPharma, im Vergleich zu den Hardware-Updates der vorherigen Generation ist in der Abbildung blau hervorgehoben. Die optionale BioPharma Edition erweitert den Qualitätsprüfbereich auf m/z=12.000 Da (grüner Feld) und die optionale ETD ermöglicht die Fraktion von ETD/EThcD (roter Feld). (Klicken Sie auf das große Bild)

Abbildung 2. KADCYLA Charakterisierung des Ablaufdiagramms.

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KADCYLA Vollmolekulargewichtsmessung unter nicht degenerativen Bedingungen

Die Messung des vollständigen Molekulargewichts ist ein wesentlicher Bestandteil der Charakterisierung von biomedizinischen Produkten, und bei ADC sind neben dem vollständigen Molekulargewicht auch die durchschnittlichen DAR-Werte und die Drogenlastverteilung (DLD) entscheidende Eigenschaften für die Beurteilung der Drogenqualität. In diesem Experiment haben wir das vollständige Molekulargewicht von KADCYLA unter nicht degenerierenden Bedingungen bestimmt. Nichtdegenerative Bedingungen verwenden neutrale Puffersalzsysteme, die Proteinmoleküle näher an ihren natürlichen Zustand stehen als degenerative Bedingungen, und unter nicht degenerativen Bedingungen ist das Protein weniger geladen, und die Massenspektrumspitzen zwischen benachbarten Ladungszuständen überlappen sich weniger, was die gegenseitigen Störungen zwischen den Massenspektrumsignalen reduzieren kann und dazu beiträgt, genauere Ergebnisse der vollständigen Molekulargewichtsmessung zu erhalten. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der vollständigen Molekulargewichtsmessung unter nicht degenerativen Bedingungen von KADCYLA. Um die Probe näher an ihren natürlichen Zustand zu bringen, entzuckerten wir sie nicht. Aus Abbildung 3A ist ersichtlich, dass auf der ursprünglichen Spektrum-Ebene, die gekoppelte Massenspektrumspitze verschiedener Anzahl von Medikamenten und verschiedener Zuckerkomponenten im Wesentlichen die Basislinie-Trennung erreichen, kann die Medikament-gekoppelte Verteilung von 0 bis 8 nach der Konvolution deutlich beobachtet werden (Abbildung 3B), und die BioPharma Finder-Software kann automatisch den durchschnittlichen DAR-Wert berechnen, der durchschnittliche DAR-Wert des ADC beträgt 3,47 (Abbildung 3C), im Einklang mit dem in der Literatur berichteten 3,5.

(A)

(B)

(C)

Abbildung 3. KADCYLA Vollkommengewichtsmessung unter nicht degenerativen Bedingungen. A, Original-Spektrum und partielle Vergrößerung. B, Auflösung des Spektrums. C. Die BioPharma Finder-Software kann die relevanten Komponenten automatisch auswählen und den durchschnittlichen DAR-Wert berechnen. (Klicken Sie auf das große Bild)

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Datenabhängige EThcD sekundäre Fragmentation für die Peptidgrafikanalyse,

Verkoppelte Positionierung und PTM-Identifizierung

Die auf Flüssigkeitskombination basierende Peptidgrafikanalyse ist eine der häufig verwendeten Analysemethoden bei der Charakterisierung von biotherapeutischen Produkten und ermöglicht Sequenzbedeckung, verschiedene chemische Modifikationspositionierung sowie qualitative und quantitative Analysen der häufigen post-translationalen Modifikationen. In einer Vielzahl von Massenspektrum-Fraktionstechniken wird es in der Peptidgrafikanalyse weit verbreitet, da HCD-Fraktionierung in der Lage ist, reichhaltige b / y-Fragmentionen für die Identifizierung von Peptidsegmenten zu erzeugen, nachdem die Peptidbindung unterbrochen wird. Jedoch für einige modifizierende Peptidensegmente, wie Glykopeptide, Verbindungs-Sub-Drogen-gekoppelte Peptidensegmente usw., da HCD die Zuckerkette / Verbindungs-Sub-Drogen-Kopplung zerstört, kann für Peptidensegmente mit mehreren potenziellen Modifikationsstellen die Verwendung von HCD-Fraktion nicht genau positionieren. Darüber hinaus können einige Peptidensegmente, die isomerisierte Aminosäuren enthalten, wie Leucin / Isoleucin, Asparagin / Asparagin-Isomerierung usw., nicht unterschieden werden, da HCD die gleiche Masse von b / y-Ionen erzeugt. Und ETD, weil der Reaktionsmechanismus unterschiedlich ist, kann sowohl das Skelett des Peptidensegments brechen, als auch die Zuckerkette, die Verbindungs-Sub-Drogenkopplung und andere Seitenkettenmodifikationen erhalten, für isomerisierte Aminosäuren können auch charakteristische Diagnoseionen erzeugt werden, um die Identifizierung und Unterscheidung von isomerisierten Aminosäuren zu erreichen. Hinzufügen von HCD-Hilfe-Fraktion, also EThcD, auf der Grundlage von ETD-Fraktion, kann gleichzeitig b / y und c / z-Ionen im gleichen sekundären Spektrum erhalten, um umfassendere Informationen zur Charakterisierung der Peptidensegmente, insbesondere der modifizierten / isomerisierten Peptidensegmente, zu erhalten. Das Excedion Pro 2-in-1 Ultrahochauflösendes Massenspektrometer mit ETD-Option ermöglicht eine schnelle, empfindliche ETD/ETchD-Fraktion, die den Datenerfassungsmodus der datenabhängigen EThcD MS2 (dd EThcD MS2) ergänzt, um umfassende Informationen zur Peptidgrafikanalyse zu erhalten.

In dieser Studie haben wir KADCYLA mit zwei Proteasen Trypsin und AspN transformiert und anschließend die dd HCD MS2- und dd EThcD MS2-Datenerfassung von Proben mit zwei verschiedenen Proteasen durchgeführt, um Informationen über Sequenzabdeckung, gekoppelte Sitzverteilung und post-translationale Modifikationen zu erhalten. Proben mit dd HCD MS2, Trypsin und AspN Enzymalyse erreichen 100% Sequenzbedeckung mit einer Probenahme (Daten nicht gezeigt). Abbildung 4 zeigt das Base Peak Chromatogramm (BPC) und die Sequenzbedeckung der Probenpeptidogrammanalyse mit dd EThcD MS2, Trypsin und AspN-Enzymen, die ebenfalls eine 100% Sequenzbedeckung mit einer Stichprobe erreichen können, was beweist, dass das ETD/ETchD-Fragment des Excedion Pro 2-in-1-Ultra-High Resolution-Massenspektrometers kompatibel mit der herkömmlichen Flusschromatografie ist und eine qualitativ hochwertige Sekundärspektrogramm für die Peptidogrammanalyse erhält.

Abbildung 4. KADCYLA Peptide Diagramm analysiert Basisspektrum und Sequenzbedeckung, beide in dd ETchD MS2 Datenerfassungsmuster. Links: Trypsin-Enzyme-Probe. Rechts, AspN-Enzymalyseprobe. Für verschiedene Protease-Enzymalyseproben kann eine 100% sequenzielle Abdeckung durch eine einzelne Probenahme erreicht werden. (Klicken Sie auf das große Bild)

Wie bereits erwähnt, ist das Konnektor-Sub-Medikament von KADCYLA (MCC-DM1) auf Lysin durch Kovalenzbindung gekoppelt und auch das N-Ende von Traumab wird gekoppelt, so dass es für das gesamte KADCYLA-Molekül 92 potenzielle gekoppelte Stellen gibt, davon 46 nicht wiederholte Stellen (Abbildung 5). Da Lysin nach der Kovalenzkopplung einen räumlichen Widerstand erzeugt, der zu einem Trypsin-Leckage führt, erzeugt die Trypsin-Enzymase eine verbindende Sub-Medikament-gekoppelte Peptidensegmente, die mehrere Lysin enthalten, während die HCD-Fraktion das Peptidensegmentskelett und das gekoppelte Medikament gleichzeitig zerstört, was dazu führt, dass es nicht möglich ist, die Drogenkopplungsstellen nur durch das HCD-Sekundärspektrum genau zu beurteilen. Während EThcD aufgrund des unterschiedlichen Fraktionsmechanismus das Skelett des Peptidensegments brechen kann, kann die gekoppelte Medikamentgruppe gleichzeitig erhalten werden, kann die optimierte HCD-unterstützte Fraktionsenergie das Fraktionieren des Peptidensegments ausreichender machen und gleichzeitig das vollständige gekoppelte Medikament maximieren. Tabelle 1 zeigt die sekundäre Fraktion der Trypsin-Enzymysate-Probe mit HCD und EThcD, die erhaltene Zusammenfassung der Drogen-Kopplungsstellen, 43 mögliche Modifikationsstellen wurden identifiziert, die Drogen-Modifikationen vorhanden sind, die mit EThcD-Fraktion sichtbar sind, für Peptidensegmente mit mehreren möglichen Kopplungsstellen können die Kopplungsstellen genau identifiziert werden, in Verbindung mit den HCD-Ergebnissen können umfassende und detaillierte Kopplungsstellen-Informationen erhalten werden.

Abbildung 5: Alle potenziellen Modifikationsstellen des KADCYLA-Moleküls, die in roten Feldern in der Proteinsequenz gekennzeichnet sind, umfassen insgesamt 92 Stellen, von denen 46 nicht wiederholt werden.

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Tabelle 1. Zusammenfassung der KADCYLA-Identifizierungsstellen

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Rote Schrift, Verbindungspunkte. "++", die gekoppelten Stellen können durch sekundäre Fragmentionsionen bestätigt werden. "+", die Kopplung an diesem Peptidensegment vorhanden ist, kann jedoch nicht durch Fragmention eine spezifische Kopplungsposition bestätigt werden. "-", keine Verbindung identifiziert.

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Bei der Enzymyse von KADCYLA mit AspN erzeugt die Schwerkette einen Peptidensegment D, der drei Lysine enthält.K(216)K(217)VEPK(221)SC， Durch die Peptidanalyse der Trypsin-Enzyme-Proben ist bekannt, dass alle drei Lysine möglicherweise gekoppelt sind. Das MCC-DM1-Konnektor-Medikament von KADCYLA enthält ein isomeres Zentrum (Abbildung 6, oben links), was dazu führt, dass die mit dem Medikament gekoppelten Peptidensegmente in Form von Spitzen auf der Reverse-Phase-Chromatografie gespült werden. Wie in Abbildung 6 gezeigt, aufgrund der Anwesenheit mehrerer potenziell gekoppelter Stellen und des MCC-DM1-IsomerierungszentrumsK(216)K(217)VEPK(221)Der Extract Ion Current (XIC) zeigt mehrere Gruppen von Spitzen. Dank des informativen sekundären Spektrums, das durch die EThcD-Fraktion erzeugt wird, ist es möglich, genau zu identifizieren, an welcher Stelle die Peptidensegmente, die mit unterschiedlichen Retentionszeiten gespült wurden, gekoppelt wurden (Abbildung 6, unten), und das relative Verhältnis jeder Modifikation basierend auf der XIC-Spitzenfläche zu berechnen (Abbildung 6, oben rechts).

Abbildung 6. Identifizierung der gekoppelten Stelle eines Peptidensegments mit mehreren gekoppelten Stellen durch EThcD. (Klicken Sie auf das große Bild)

Für ADC-Proben sind neben den Arzneimittelkopplungsstellen auch verschiedene mit der Arzneimittelqualität verbundene Posttranslationsmodifikationen charakterisiert und überwacht. Abbildung 7 zeigt ein sekundäres Fraktionsspektrum auf der Grundlage von EThcD für die Peptidensegmente FNWYVisoD(283)Identifikationsergebnisse der Isomerierung von Asparaginsäure von GVEVHNAK. Dank der hohen Empfindlichkeit und der hohen Qualitätsgenauigkeit der Instrumentenplattform können reichhaltige c/z-Ionen sowie die charakteristischen c+57/z-57-Ionen, die durch Asparaginsäure-Isomerierung während der ETD-Fraktion erzeugt werden, auch wenn der relative Gehalt nur 0,18% des unmodifizierten Peptidensegments ist, die Bestätigung der Asparaginsäure-Isomerierung erzielt werden. Relative quantitative Ergebnisse sind für andere gängige Nachtranslationsmodifikationen wie Dexamid, Oxidation und Glykoxylierung erhältlich (Abbildung 8).

Abbildung 7. Bestätigung der Asparaginsäure Isomerisation mit EThcD Fraktion. Die lokal vergrößerte Abbildung unten zeigt das Ion c+57/z-57. (Klicken Sie auf das große Bild)

Abbildung 8. Andere gängige nach der Übersetzung modifizierte relative quantitative Ergebnisse, alle als Drei-Pin dd ETchD MS2 wiederholte Probenmittel. A, Methyleninoxidation. B, Aspartamid-Dexamid. C, Aspartamid Ambramidierung. D, Tritonische Oxidation. E, Schwerkettene N-Glykolysation. (Klicken Sie auf das große Bild)

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Zusammenfassung

Dieser Artikel zeigt die Ergebnisse der Charakterisierung des Lysin-gekoppelten ADC KADCYLA mit dem 2-in-1-Ultra-High-Resolution-Massenspektrometer der neuen Generation Excedion Pro BioPharma. Die vollständige Molekulargewichtsmessung von KADCYLA unter nicht degenerierenden Bedingungen kann die Verteilung der Anzahl der Drogenkopplungen von 0 bis 8 unter Nicht-Dezuckerbedingungen messen, der durchschnittliche DAR-Wert von 3,47 nach der Softwarebehandlung erreicht wurde, was im Einklang mit dem berichteten Wert von 3,5 ist; Die schnelle und empfindliche EThcD-Fraktion ermöglicht nicht nur eine 100% Sequenzbedeckung der einzelnen Probenahme, die häufige Identifizierung und relative Quantifizierung der Modifikationen nach der Übersetzung, sondern auch die Identifizierung von gekoppelten Stellen, die Identifizierung von isomerisierten Aminosäuren usw., um zuverlässige Ergebnisse für die umfassende Charakterisierung komplexer Biomoleküle zu liefern.

Referenzen:

[1] Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Antikörper-Medikamentkonjugat: die "biologische Rakete" für gezielte Krebstherapie. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022).

[2] https://assets.roche.com/f/176343/x/38d96ed8ec/fb24e.pdf

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C., Denevault-Sabourin, C. Antikörper-Drogenkonjugate: Das letzte Jahrzehnt. Pharmazeutika 2020, 13, 245.

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