Einer,Vollautomatische PCRVorbereitung vor der Operation
Reagenzien und Verbrauchsmaterialbereitung
Reagenzien: DNA-Schablonen, spezifische Vorläufer (vorwärts und rückwärts), dNTPs (vier Deoxyribose-Nukleotide), hochtemperaturbeständige DNA-Polymerasen wie Taq-Enzyme, Puffer und Mg²+-Ionenlösungen. Alle Reagenzien müssen nach vollständiger Schmelze vermischt werden, um Konzentrationsfehler zu vermeiden.
Verbrauchsmaterialien: Verwenden Sie sterile Einweg-PCR-Röhren oder 96-Loch-Platten, um eine gute Dichtung zu gewährleisten und Kreuzkontamination zu verhindern.
Partitionierungsbetrieb: Fertigstellung des Systems im Reagenzverbereitungsbereich (ultrareiner Arbeitstisch oder Biosicherheitsschrank), Handschuhe tragen und sprechen vermeiden, um die Aerosolverschmutzung zu reduzieren.
Instrumentsprüfung
Stellen Sie sicher, dass das PCR-Gerät auf einer festen horizontalen Plattform platziert ist, dass die Versorgungsspannung übereinstimmt und gut geerdet ist.
Prüfen Sie, ob die Probenbehälter sauber sind, um zu vermeiden, dass Rückstände die Temperaturleitung beeinflussen.
Reinigen Sie die Proben regelmäßig mit Seifenwasser, starke Alkalinen, hohe Alkoholkonzentrationen oder organische Lösungsmittel sind verboten.
II. Herstellung des Reaktionssystems
Mischmittel
Die DNA-Schablonen, die Vorläufer, die dNTPs, die DNA-Polymerase, die Puffer und die Mg²+-Lösung werden proportional in sterile Zentrifugerrohre gegeben und die angemessene Menge an Doppeldampfwasser bis zum Endvolumen kondensiert (empfohlen 15-50 µL).
Schlüsselparameter:
DNA-Schablonenqualität: Vermeiden Sie Abbau oder Inhibitor-Kontamination, die sonst die Amplifikationseffizienz beeinträchtigt.
Prototyp-Design: Gewährleistung der Spezifizität, Vermeidung von Diomeren oder Selbstkomplementären Strukturen, und die Ausbrenntemperatur muss mit dem Prototyp-Tm-Wert übereinstimmen.
Mg²+-Konzentration: Zu hoch oder zu niedrig hemmt die Enzymaktivität und muss entsprechend der Reagenzanleitung angepasst werden.
Aufteilungssystem
Die Mischung wird schnell in ein PCR-Röhrchen aufgeteilt, das Röhrchendeckel oder eine spezielle Membran bedeckt und kurzzeitig zentrifugiert (1000-2000 U/min, 1 Minute), um die Flüssigkeit auf den Grund des Röhrchens zu versenken.
PCR-Verfahren einrichten
Temperaturprozessparameter
Anfangsdegeneration: 94-98 ° C, 20-30 Sekunden, so dass die Doppelkette der DNA vollständig getrennt ist.
Kreislaufdeformation: 94-98 ° C, 20-30 Sekunden, Einkettenzustand aufrechterhalten.
Ausbrennen: 50-65 ° C, 20-40 Sekunden, die Vorlage und die Schablonenspezifischkeit kombiniert werden (die Ausbrenntemperatur muss durch Gradient-PCR optimiert werden).
Verlängerung: 72 ° C, 1 min / kb DNA-Fragmente, Taq-Enzym synthetisiert neue Ketten.
Anzahl der Zyklen: 20-40 Mal, entsprechend der Fülle der Zielsegmente angepasst.
Endverlängerung: 72 ° C, 5-10 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Segmente vollständig verlängert werden.
Lagertemperatur: 16 ° C, 2 Minuten (Vermeiden Sie übermäßigen Verschleiß des Kompressors, verboten Einstellung auf 4 ° C unbegrenzte Lagerung).
Erweiterte Funktionseinstellungen
Temperaturgradient: Setzen Sie einen Temperaturgradient (z. B. 50-65 °C) während des Brütungsschritts und testen Sie mehrere Brütentemperaturen zur Optimierung der Versuchsbedingungen.
Ramp Rate: Anpassung der Erwärmungs-/Abkühlgeschwindigkeit (z. B. 3°C/s), um die Reaktionszeit zu verkürzen.
Inkrement: Eine Temperatur- oder Zeiterhöhung nach jedem Zyklus (z.B. 0,1 ° C pro Zyklus) ist für spezielle Experimente wie Touchdown PCR geeignet.
Programm speichern und ausführen
Nach der Eingabe des Programmnamens speichern, legen Sie die PCR-Röhre in den Probenschlitz, schließen Sie den Wärmedeckel und drehen Sie ihn fest.
Starten Sie das Programm und überwachen Sie die Temperatur und die Zeit in Echtzeit über den Bildschirm während der Ausführung, unterstützen Sie Pausen, Schritte überspringen oder beenden Sie das Programm.
4. Nachbehandlung des Experiments
Produktanalyse
Unmittelbar nach Beendigung der Reaktion werden die PCR-Röhrchen entnommen und die Produktgröße und -konzentration mittels Ionasegel-Elektrophoresis oder Fluoreszenztests wie SYBR Green analysiert.
Wenn Sie eine Fluoreszenzmarkering verwenden, müssen Sie sicherstellen, dass die Instrumentparameter (z. B. Anregungswellenlänge, Verstärkungswert) mit dem Reagenz übereinstimmen, um Hintergrundsignalstörungen zu vermeiden.
Wartung der Geräte
Vor dem Ausschalten des Instruments kühlt das zu beheizende Modul natürlich auf Raumtemperatur ab, um thermische Belastungsschäden zu verhindern.
Kalibrieren Sie Temperatursensoren regelmäßig, um die Temperaturgenauigkeit zu gewährleisten (z. B. mit Standard-Schmelzpunktkalibratoren).
Reinigen Sie Probenschlitze und Wärmedeckel, prüfen Sie, ob der Dichtring veraltet ist, und ersetzen Sie Abfallteile rechtzeitig.
Fünf,Vollautomatische PCRHinweise
Verschmutzungsschutz
Das gesamte Experiment folgte dem Prinzip der Nukleensäurefreiheit und verwendete spezielle Pipetten, Pistolenkopfe und Arbeitskleider, um Kreuzkontamination zu vermeiden.
Einrichten von negativen Kontrollen (ohne Vorlage) und positiven Kontrollen zur Überwachung der Zuverlässigkeit des experimentellen Systems.
Sicherheitsbetrieb
Vermeiden Sie das Öffnen der Wärmekappe während des Betriebs des PCR-Geräts, um Verbrennungen bei hohen Temperaturen oder die Verdunstung der Probe zu verhindern.
Es ist verboten, korrosive flüssige Reinigungsgeräte zu verwenden, um Schäden an elektronischen Komponenten zu verhindern.
Fehlerbehebung
Keine Vergrößerungsprodukte: Überprüfen Sie die Qualität der Schablone, das Design der Vorlage oder die Verfahrensparameter (z. B. eine zu hohe Ausbrenntemperatur).
Nicht-spezifische Streifen: Optimieren Sie die Ausbrenntemperatur oder erhöhen Sie die Verlängerungszeit, um die Diomerbildung zu reduzieren.
Temperaturschwankungen: Kontaktieren Sie den Ingenieur zur Kalibrierung des Instruments, um sicherzustellen, dass die Temperaturgleichmäßigkeit den Normen entspricht (z. B. ± 0,2 ° C).