Die Schätzung der Anzahl von EVs, die Bestimmung des Vorhandenseins von EVs und die Bewertung des Anteils und der Auswirkungen von nicht-EV-Komponenten in der EV-Vorbereitung erfordern die Charakterisierung von EVs. Die Charakterisierung von EV stellt sich vor den Herausforderungen kleiner Partikelgrößen, Dimensions- und Molekularheterogenitäten, fehlender allgemeiner EV-Identifikationsmethoden und nicht-EV-Spezifischkeiten vieler Messtechniken.Keine einzelne Messung oder Methode erfüllt alle Anforderungen an die EV-Charakterisierung, daher wird empfohlen, eine orthogonale Methode zu verwenden, die keine gleichen Messgrenzen aufweist.Das heißt, dass die Charakterisierungsparameter von EV als kritische Qualitätseigenschaften (CQA) empfehlen, den gleichen Indikator mit zwei oder mehr verschiedenen Prinzipien zu erkennen.
Die Gesamtzusammensetzung von EV (Gehalt und Verhältnis von Proteinen, Lipiden, Nukleinsäuren und anderen Biomolekülen usw.) variiert je nach EV-Quelle. Obwohl Messungen dieser einzelnen Molekülkategorien zur Schätzung der EV-Fülle verwendet werden können, sind diese Werte nicht unbedingt mit allen EV-Konzentrationen verbunden und es gibt keine Universalität zwischen den Ausgangsmaterialien; Daher,Sie werden nicht als Maß für die EV-Konzentration verwendet.Genauso wie kein einzelner Molekulartest alle EV quantifizieren kann, gibt es keine allgemeinen molekularen Markierungen für EV oder EV-Subtypen. Eine spezifische Kennzeichnung muss auf der Grundlage von Beweisen für Quellenspezifizität und Typenspezifizität ausgewählt werden. Derzeit,Es gibt noch keine bekannten allgemeinen Markierungen, die alle EVs unabhängig von ihrer Herkunft identifizieren können.Für die sogenannten Exosomen ist die Universalität dieser Marker unklar oder nicht akzeptiert. Beachten Sie bitte, dass die Affinitätsbasierten Programme, die die vier Transmembranproteine CD9, CD63 und CD81 umfassen, nicht spezifisch für Exotrome als EV-Subtypen sind; Eine EV-Population angereichert mit Antikörpern gegen eines dieser vier transmembranen Proteine kann nicht ohne umfassende Abdeckung aller molekularen Zusammensetzung. Darüber hinaus drücken nicht alle EVs diese Proteinmarker aus, so dass die vierfache transmembrane Proteinanreicherung nicht alle EVs erfasst.Ortogonale Methode zur Erkennung derselben Charakterisierungsparameter(Mehr als ein Prinzip)Es ist unwahrscheinlich, die gleiche Abweichung zu haben; Zum Beispiel wird der Durchmesser eines EV durch optische und nicht-optische Methoden gleichzeitig abgeleitet und erkannt.Die Verwendung einer orthogonalen Methode zur Charakterisierung von EV-Proben ist ebenfalls entscheidend, um zu beweisen, dass Co-Isolate nicht mit Biomarkern oder funktionellen Entdeckungen verbunden sind.Da viele EV-Charakterisierungsmethoden nicht spezifisch für EV sind oder nicht alle EV erkennen können, müssen Methoden und Ergebnisse transparent veröffentlicht werden, um die Wiederholbarkeit der EV-Daten zu gewährleisten.
1. Quantifizierung der Partikelkonzentration
Die Menge und die Volumenmessung von EV definieren zusammen die numerische Konzentration (in Partikeln/mL), ein weit verbreiteter und verwendeter Indikator. Es ist jedoch in der Regel nicht zuverlässig, da viele Technologien keine EV-Spezifikation und Empfindlichkeit für alle EVs haben.Die ISEV-Arbeitsgruppe für strenge und standardisierte EV-Referenzmaterialien hat kürzlich die Überlegungen der Messtechnik und die Herausforderungen im Bereich der nachverfolgbaren Messung, Entwicklung und Berichterstattung von gut charakterisierten EV-Referenzmaterialien dargestellt. Ein wichtiges Highlight dieser Arbeit ist die Notwendigkeit, die LOD der Testmethode zu veröffentlichen, damit andere die Ergebnisse unabhängig von Empfindlichkeitsbegrenzungen verifizieren können.Verbesserte Zuverlässigkeit der EV-Konzentrationsmessung durch den Einsatz von orthogonalen Methoden，Jede Methode hat eine bestimmte LOD, z.B. zur Erkennung der Lichtstreuungstärke(wie NTA)Fluoreszenzstärke(wie FCM)und physische Größe(wie RPS)Weil die orthogonale Methode keine gleichen Messgrenzen hatZum Beispiel kann mit der Resistance Impulse Sensing (RPS)-Technologie LOD in der Partikelgröße angegeben werden. Für optische Techniken wie die Flusszytometrie kann LOD mit einem Durchmesser, der sich aus einem optischen Lichtstreuungsmodell ergibt, oder mit einem äquivalenten löslichen Fluorescentmolekül (MESF), das sich aus der Fluoreszenzintensität ergibt, gemeldet werden. Diese Methoden können konsistente Daten zwischen verschiedenen Instrumenten und Empfindlichkeiten erzeugen. Da die Teilchenerkennung eine Vielzahl von Variablen umfasst,Derzeit gibt es keine Methoden für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und die Dynamische Lichtstreuung (DLS).)Oder Bildgebung Flow-Zytologie für nachverfolgbare LOD.Für Technologien, bei denen EV nicht von anderen potenziellen Co-Separatoren oder Schadstoffen unterschieden werden kann, wird es empfohlen, den Konzentrationsbericht als "Partikelkonzentration oder EP-Konzentration" und nicht als "EV-Konzentration" anzugeben, unabhängig von den Upstream-Trennungsschritten.
2. Quantifizierung der Partikelgröße
Die Messung der EV-Größe (in Nano-Radius oder Durchmesser) hängt von Annahmen wie Kugelform oder Migrationsrate ab, und die Ausgabeergebnisse können von Upstream-Variablen beeinflusst werden. Häufige Methoden mit hohem Durchfluss, einschließlich Flow-Zytologie, NTA、RPS、 Mehrwinkel-Lichtstreuung und dynamische Lichtstreuung (DLS) gehen davon aus, dass EV kugelförmig ist. Obwohl die Begriffe "Größe" und "Durchmesser" häufig zwischen den Messmethoden miteinander verbunden sind, können ihre Ableitungen auch zu konsistenten Unterschieden zwischen den Messtechniken führen. Zum Beispiel:Techniken, die sich auf die braune Bewegung der Partikel stützen, wie NTA oder DLS, messen den Durchmesser der Flüssigkeitsdynamik, was zu einer überschätzten Partikelgröße im Vergleich zu Bildgebungsmethoden wie dem Gefrierelektroskop führt.Es gibt nur wenige Möglichkeiten, die EV-Größe im gesamten möglichen Durchmesserbereich (von Dutzenden von Nanometern bis hin zu Mikron) genau zu messen. Zum Beispiel, obwohl die hochauflösende Bildgebung mit einem Gefrierelektroskop eine der genauesten Methoden ist, hat es einen relativ niedrigen Erkennungsfluss und viele größere EV neigen dazu, eine geringere Anzahl zu haben, die möglicherweise nicht quantifiziert werden kann. Die Fähigkeit zu quantitativen niedrigen Kontrasten EV unter 100 nm kann auch ein Einschränkungsfaktor sein.
Da immer mehr Forscher spezielle, empfindlichere Einzelpartikelanalysetechniken verwenden, wird immer klarer, dass viele EV-Präparate eine asymmetrische rechte Partialverteilung aufweisen, wie z. B. eine logarithmische Normalverteilung, bei der die meisten EV-Durchmesser <100 nm sind. Die meisten Einzelpartikelanalysetechniken können nicht die gesamte EV-Population analysieren, daherForscher sollten die erkannte EV-Durchmesserverteilung teilen，Nicht nur aggregierte Indikatoren wie Durchschnittsgröße, Konzentrationsgröße oder MittelgrößeDiese Indikatoren können aufgrund der LOD und der asymmetrischen Größenverteilung leicht geneigt werden. Bitte beachten Sie,Passende Größenstatistiken, wie z. B. die Messung von Partikeln mit niedrigem Brechungsgrad mittels NTA, können dem LOD des Instruments näher liegen als dem realen Modendurchmesser der EV-Gruppe.Die Verwendung von Software mit proprietären Algorithmen zur Bestimmung der Partikelgröße kann auch zu Unterschieden zwischen Softwareversionen oder Softwareplattformen führen, und daher sollten auch die Software und ihre Versionen bereitgestellt werden.Techniken, die Größen aus Brechungshypothesen ableiten, können sich aufgrund unterschiedlicher Probenkomponenten und -lasten ändern.Die Größe, die von einer Fluoreszenzsonde abgeleitet wird, wie z. B. einem Membraneinbetteten Farbstoff, kann sich durch unterschiedliche Farbstoffeinbettungen auf der Grundlage unterschiedlicher Membranenlipde ändern. Für Technologien, bei denen es nicht möglich ist, EV und Co-Separator / Schadstoff unabhängig von den Upstream-Trennungsschritten zu unterscheiden, wird empfohlen, den Durchmesserbericht als "Partikel" oder "EP" Durchmesser und nicht als "EV-Durchmesser" auszudrücken.
Hinweise zu spezifischen Berichten zur EV-Charakterisierung
Mit der Ausweitung des Einsatzes von EV-Prüfexperimenten und -instrumenten sowie des Expertenwissens wird auch die Definition der relevanten Charakterisierungsberichtsskalen zunehmen, um die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit der Daten zu gewährleisten. Die MISEV2023-Leitlinie enthält eine detaillierte Liste der Vorsichtspunkte für minimale Experimente und instrumentspezifische Berichte. Diese gelten in der Regel, unabhängig vom Design des Experiments. Die hier aufgeführten Technologien sind nicht vollständig und viele Testtechniken werden entwickelt oder aktiv untersucht. Allerdings sind alle aufgeführten Techniken kommerziell verfügbar und es gibt veröffentlichte Literatur von mehreren Forschern. (Aufgrund der Breitenbeschränkung liste ich hier nur die Beschreibung einiger der derzeit häufig verwendeten Werkzeuge zur Charakterisierung von EV-Partikelgrößen und -konzentrationen und ihre wichtigsten Ansichten auf.)[Flow-Zytologie auf der Grundlage von Mikroperlen]ISEV empfiehlt, dass die Kontrollgruppe einen homotypen Antikörper oder homotypen gekoppelte Erfassungsmikroperlen umfassen sollte, die als Antikörper zur Detektion dienen, sowie eine Erfassungsmikroperle, die nur einen Antikörper zur Detektion enthält (eine Erfassungsperle für Antikörper-Verpackungen); Mehrere EV-Probenkonzentrationen sollten verwendet werden, um die Titration des Signals zu zeigen; Bei der Herstellung von Mikroperlen sollten ihre Reagenzien und chemische Zusammensetzung veröffentlicht werden; Verzeichnisse und Chargennummern von kommerziellen Mikroperlenreagenzien werden ebenfalls veröffentlicht; Veröffentlichung der mittleren Fluoreszenz-Intensitätswerte der standardisierten Mikroperlen; Veröffentlichung von Daten und Statistiken über die mittlere Fluoreszenz-Intensität von äquivalenten löslichen Fluoreszenz-Molekülen (MESF) aus monostatischen Mikroperlen (wie bei der Single EV Stream-Zytologie); Eine vollständige und detaillierte Methodik muss veröffentlicht werden.[Single-EV-Stromzytologie]Im Jahr 2023 wurde durch die Initiative der dreifachen Arbeitsgruppe der Internationalen Gesellschaft für Exzelluläre Veskeln (ISEV), der Internationalen Gesellschaft für Fortschritte in der Zellzählung und der Internationalen Gesellschaft für Thrombotherapie und Hemostatik (EV-Flow-Zytologie-Arbeitsgruppe) die Single-EV-Flow-Zytologie veröffentlicht, um die Aufmerksamkeiten bei der Entwicklung eines Single-EV-Flow-Zytologie-Tests umfassend anzugehen.Die Kalibrierung von Probenvolumen-, Fluoreszenz- und Lichtstreuungsparametern ist für die Interpretation und Reproduktion der Ergebnisse eines einzelnen EV-Streams entscheidend. Wenn Sie eine Partikelkonzentration mit einem einzelnen EV-Stromzytometer melden, bestimmen Sie die oberen und unteren Grenzen der LOD, um die Verwendung von orthogonalen Methoden oder anderen zu ermöglichen, um das Ergebnis zu wiederholen und zu verifizieren.Derzeit, Bildgebung Zytometrie verwendet dynamische Trigger-Methoden, die die Bestimmung einer niedrigeren LOD schwierig zu definieren und somit schwierig zu standardisieren.DLS， Auch als Photonen-assoziierte Spektrologie (PCS) und quasi-elastische Lichtstreuung (QELS) bekannt, ist eine Technik, die den flüssigkeitsdynamischen Durchmesser der vollständig monodispersen Partikel in einer verdünnten Wasserlösungsdispersion bestimmen kann. Der DLS misst die selbstbezogene Funktion der Laserintensität, die mehrere Partikel in einer Lösung streuen. Da die korelativen Funktionen Informationen über die Partikeldiffusionskoeffizienten tragen, die durch die Stokes-Einstein-Brown-Bewegungstheorie mit dem Durchmesser der Flüssigkeitsdynamik verbunden sind.Die Diffusionskoeffizienten können mit mehreren Algorithmen aus gemessenen Selbstkorrelationsfunktionen exportiert werden. Die häufigste Methode ist die kumulative Analyse, aberEs geht davon aus, dass die Proben eine monodisperse Größenverteilung haben, während die EV-Probe diese Verteilung nicht hat.Für die multidisperse Größenverteilung von EV-Proben wird die Koeffizienzverteilung der Diffusion, die von den verwandten Funktionen abgeleitet wird, zu einem ungeeigneten mathematischen Problem. Das bedeutet:DLS wird nicht zur Bestimmung der quantitativen Eigenschaften von EV-Proben angewendetEs sei denn, DLS gilt für einen Teil des EV mit einer einzigen dezentralen Größe. Auf der anderen Seite kann DLS verwendet werden, um das Vorhandensein von Submikron-Partikeln und möglichen Aggregaten in EV-Proben qualitativ zu bestätigen.Verschiedene Elektronenmikroskope (EM) sind eine der wenigen Technologien, die EVs (unabhängig von ihrer Größe) erkennen können. Der Durchfluss des Elektroskops bedeutet jedoch auch, dass größere EVs im Vergleich zu kleineren EVs statistisch unterschätzt werden. SEM, TEM und Cryo-EM sind alle hochauflösende EV-Charakterisierungsmethoden, die nicht miteinander wechseln müssen oder in der Lage sind, Bilder mit vergleichbarer Qualität zu liefern. Zum Beispiel:Cryo-EM kann die Lipid-Doppelschicht-Struktur eindeutig anzeigen, die EV-Form besser als TEM bei Dehydratierungsbedingungen für die Fixierung der Probe aufrechterhalten und möglicherweise eine genauere Menge (Größe) bestimmen,Denn alle Partikel in einem bestimmten Volumen können abgebildet werden, nicht nur die, die an der Trägerfläche haften.Standardisierte Untersuchungen zu EM-Methoden zur Festlegung niedriger Berichtsanforderungen sind sehr begrenzt. Für TEM sollten drei Hauptparameter veröffentlicht werden: Fixierung, Adsorption und negative Färbung. Fixierung umfasst: das verwendete Fixierungsmittel und seine Konzentration und Inkubationszeit; Die Adsorption umfasst das Trägermaterial, die Trägergröße, den Filmtyp, die Beschichtung, die Inkubationszeit und die Reinigungsdetails; Details zur negativen Färbung sollten das Substrat, die Konzentration und die Inkubationszeit umfassen. Darüber hinaus sollten Bilder mit niedriger und hoher Vergrößerung sowie Auswahlkriterien für Bilder veröffentlicht werden.Nanopartikel-Tracking-AnalyseNTA， Auch als Einzelpartikelverfolgung bezeichnet, ist eine optische Technik, die im Bereich der Elektrofahrzeuge weit verbreitet wird, um Partikelgrößen und -konzentrationen zu schätzen. NTA verwendet in der Regel Algorithmen, die die Veränderungen der Durchmesserverteilung reduzieren, um einen fluiddynamischen Durchmesser durch die Messung des Diffusionskoeffizienten von Partikeln zu ermitteln. Es ist bemerkenswert,Der FTLA-Algorithmus, der auf einigen NTA-Geräten verwendet wird, wurde entwickelt, um eine bessere Darstellung einer einzelnen, dezentralen Mischung zu ermöglichen, während der EV nicht, was zu einer künstlichen Vielfalt der passenden Verteilungen führen kann.Darüber hinaus gibt es derzeit keine Möglichkeit, LODs für NTA-Einstellungen zu bestimmen oder zu veröffentlichen. Viele Wissenschaftler haben mehrere standardisierte Studien durchgeführt, um die Ergebnisse zwischen Benutzern und Instrumenten zu vergleichen.Durchmesserverteilung und Konzentration komplexer Bioflüssigkeitsproben mit NTA sollten vorsichtig erklärt werdenweil es Co-Isolate wie Lipoproteine und große Proteinkomplexe zählt undNTA hat Schwierigkeiten, EVs mit Durchmessern von mehreren Hundert Nanometern zu quantifizieren.Für NTA-Veröffentlichungen sollten das Gerätemodell, der Kameratyp, die Kameraeinstellungen, die Laserwellenlänge, die Laserleistung, die Softwareversion, die Analyseeinstellungen und die Teilchen pro Bild enthalten sein. Wenn bekannt, dannDer Algorithmus zur Erzeugung der Durchmesserverteilung sollte veröffentlicht werden, da je nach verwendetem Algorithmus unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden können.Bei Lichtstreuung oder Fluoreszenzdetektionsmodus wird die Verwendung eines leeren Puffers als Kontrolle empfohlen. Bei fluoreszierenden NTAs werden die Gesamtzahl der Partikel im Lichtstreuungsmodus und die Anzahl der Markierungspartikel im Fluoreszenzmodus sowie die Methode zur Markierungsentfernung und die Puffer-/Reagenzkontrolle gemeldet, um die Fälschung der Markierung zu bewerten.Wenn ein flüssiges Gerät verwendet wird, sollten auch seine Einstellungen veröffentlicht werden..Dies ist das erste Mal, dass MISEV die Resistance Impulse Sensing (RPS)-Technologie als empfohlene Methode zur Charakterisierung von EV-Partikeln parallel zu strombasierten Methoden (einschließlich mikroperlenbasierter Strömungen und einzelner EV-Strömungen) und mikroskopischen Methoden (einschließlich Atomkraftmikroskope, Elektroskope, DLS, NTA, Ultraresolutionsmikroskope usw.) verwendet. Es ist auch eine der wenigen nicht-optischen Prinzipien der EV-Charakterisierungstechnik.RPS verwendet das Kurter-Prinzip, um die Konzentration und den Durchmesser von Partikeln zu bestimmen, und einige Geräte haben auch eine zeta-Potentialfunktion. Derzeit ist der Durchmesser des RPS LOD auf ~50 nm niedrig. Die Literatur berichtet,RPSDie Messungen sind tatsächlich mitTEMDie Daten sind sehr konsistent.Bei der Berichterstattung von RPS-Daten wird empfohlen, das Instrumentmodell, die Apertur, den kalibrierten Mikroperlendurchmesser und die Quelle sowie die Softwareversion zu veröffentlichen. Wie bereits erwähnt (Quantifizierung der Partikelgröße), für EV-Daten,Es wird empfohlen, die Durchmesserverteilung des RPS und nicht die Statistik eines einzelnen Durchmessers zu veröffentlichen. Es wird auch empfohlen, die Kontrolle des leeren Puffers zu integrieren, um den Hintergrund zu erkennensowie die gleiche Konzentration des Entverschmutzungsmittels nach dem Crack der Probe, um das markierte Ereignis zu bestimmen. Da die RPS-Technologie leicht durch größere Partikel verstopft wird, können größere Partikel mit Voranalyseschritten wie Zentrifuge oder Filterung entfernt werden. Da diese Methoden die analysierte EV-Gruppe verändern und den Vergleich zu orthogonalen Methoden beeinflussen können, sollten alle Vorbehandlungsverfahren vor der Analyse eindeutig beschrieben werden.Detaillierte Informationen zur Proteinanreicherung und Quantifizierung sind erforderlich; Wenn möglich, positive und negative Kontrollen des Antigens einzubeziehen; Wenn behauptet wird, dass das Protein mit EV verbunden ist, ist eine Reinheitsmessung der EV-Präparate erforderlich. Melden Sie alle Einzelheiten zur Standardisierung von Oberproben, Gelelektrophoresis, Transformationsmethoden, Sonden und Bildgebung/Analyse (einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Antikörperinformationen, Degeneration und Reduktionsbedingungen der Probe, Transformationsmethoden, Membrantypen, Puffer sowie Bildgebungsgeräte und -parameter); Unbeschnittene Bilder aller WB zur Verfügung stellen (wenn sie in einer Zeitschrift veröffentlicht werden, benötigt sie als ergänzende Informationen).Der Leitfaden behandelt die verschiedenen Ansätze zur EV-Charakterisierung in den oben genannten Kapiteln und bietet spezifische Empfehlungen. Unabhängig von der verwendeten Methode sind die allgemeinen Empfehlungen für die Charakterisierung wie folgt zusammengefasst:
- Jedes EV-Präparat sollte durch quantitative Messungen der EV-Quelle definiert werden (z. B. die Anzahl der sekretierenden Zellen, das Volumen der Bioflüssigkeiten, die Gewebemasse usw.).
- Die Fülle des EV sollte geschätzt werden (einschließlich der Anzahl der Partikel, des Proteins und / oder des Lipids).
- Abhängig von der für den experimentellen Zweck erforderlichen Spezifizität sollte nachgewiesen werden, ob die EV-Präparate Inhaltsstoffe enthalten, die mit dem EV-Untertyp oder dem EV zusammenhängen.
- Bestimmen Sie das Vorhandensein von nicht-follikulären, getrennten Komponenten.
- Wenn ein EV mit quantitativen Indikatoren charakterisiert wird, ist eine Messgrenze (LOD) für das Instrument oder die Methode erforderlich.
