Extrazelluläre Veskeln (EV) hat sich in den vergangenen zehn Jahren schnell entwickelt und es wurden zahlreiche Erkenntnisse und Berichte in Bezug auf ihre Herkunft, Krankheitsrelativität sowie Diagnose und Behandlung gemacht. In diesen Forschungsbereichen ist eine umfassende Charakterisierung von EV von entscheidender Bedeutung und erfordert die Abdeckung von EV-Einzelpartikel- und Gesamtanalysen wie Korngröße, Potenzial, Konzentration, Partikelgrößenverteilung sowie die Erkennung von EV-bezogenen charakteristischen Proteinen wie CD9, CD63, CD81, Alix und TSG1012-5. Für eine tiefergehende Analyse der EV-Phänotype ist eine EV-Phänotypanalyse mit Methoden wie Western Blotting, ELISA oder Single Vessel / Total Immunmarker erforderlich.
Derzeit gibt es keine Möglichkeit, das Protein auf einzelnen Bläschen mit der Gesamtheit zu erkennen.PartikelgrößenverteilungKombiniert mit der Konzentrationsmessung. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine Technik zur Charakterisierung der EV-Korngrößenverteilung. NTA basiert auf der Stokes-Einstein-Gleichung durch die Verfolgung einzelner TeilchenBraune BewegungBestimmen Sie die Größe eines einzelnen EV und einer EV-Gruppe. NTA ermöglicht die spezifische Anregung von fluoreszierenden Farbstoffen und die Erkennung von fluoreszierenden Markierungen von EV (NTA-FL) durch Laserbeleuchtung von Partikeln.Nur wenige Studien haben NTA-FL jedoch streng bewertet, und diese basieren auf atypischen EV-Proteinzielen oder Immumarkern mit nicht spezifischen Markern..
Tufts Universität (USA)Tufts UniversitätDie Forscher berichteten über einen fluoreszierenden Immumarker für einzelne EV für NTA-FL-Optimierungsalgorithmus, der NTA-basierte Immumarker für einzelne Veskeln und Prüfung mit Korngrößenverteilung und Konzentrationsanalyse genauer macht. Der Algorithmus kann die Glaubwürdigkeit der NTA-Testergebnisse effektiv verbessern und bietet leistungsstarke Werkzeuge, um die Funktionen und Mechanismen von EVs tiefer zu untersuchen..
In früheren Studien fanden die Forscher traditionelle利用NTAdurchführenEVFluoreszenz der Subtyp-Analyse/Datenabweichungen auftreten bei der StreulichtvergleichsmethodeNormalerweise kann das Verhältnis der Fläche, die von der Fluoreszenzkurve (FM) umgeben wird, zur Fläche, die von der Streulichtkurve (LSM) umgeben wird, die Reinheit von EV anzeigen. Diese Forscher fanden jedoch während der Analyse heraus, dass das Verhältnis von FM (blaue Linie) zu LSM (rote Linie) in Tests 1, 2, 4 (Tabelle 1, Abbildung 1) größer als 100% war, was darauf hindeutet, dass die EV-Reinheit größer als 100% war, was offensichtlich nicht vernünftig ist.1. Bei der Fluoreszenzverkennung kann eine Menge falscher Signale auftreten.
Die technischen Einschränkungen des NTA-Systems führen dazu, dass das LSM sehr kleine EV oder andere Partikel mit niedrigem Brechungsgrad nicht erkennen kann.Die EV-Erkennung im Streulichtmodus ist unvollständig, einige EV-Daten wurden nicht erkannt, so dass die LSM-Fläche klein ist, was zu einem Verhältnis von mehr als 100% führt.
Die Forscher fanden auch heraus, dass FM-Muster offensichtliche Signalspitzen in Bereichen unter 50 nm aufweisen, während im Gegensatz zum LSM-Muster die Signalverdämpfung unter 50 nm grundsätzlich auf 0 liegt, was auch einer der Gründe sein könnte, warum das Verhältnis größer als 100% ist.Insbesondere kann es sein, dass freie fluoreszierende Moleküle nicht ausreichend entfernt wurden und dass freie Proteine im System durch fluoreszierende Moleküle gekennzeichnet wurden, was zu einer verstärkten fluoreszierenden Signalisierung in kleinen Partitionen führt.
Tabelle 1 Verhältnis zwischen Fluoreszenzfläche (FM) und Streulichfläche (LSM) für verschiedene ProbenAbbildung 1 NTA-Testergebnisse verschiedener Proben im FM-Modus und im LSM-Modus
Um diese Situation zu lösen, haben die Forscher zwei Bewertungsmethoden vorgeschlagen:
Die erste MethodeEs ist eine herkömmliche Berechnungsmethode, bei der die Anzahl der Partikel in einer Probe, die größer als 50 nm ist, berechnet und die Anzahl der Partikel in FM und LSM verglichen wird, um das Verhältnis zwischen FM und LSM zu ermitteln. (Abbildung 2b, c)
Die zweite MethodeEs ist eine optimierte Berechnungsmethode, die den Überlappungsbereich zwischen den beiden Methoden erhaltenen Korngrößenverteilungskurven berechnet und den Bereich mit der Gesamtzahl von Partikeln im LSM vergleicht, die größer als 50 Nanometer sind, um ein Überlappungsbereichsverhältnis zu ermitteln. (Abbildung 2d)
Während der Studie betonten die Forscher ihre Kompromisse bei der Partikelgrößenauswahl. Um EV genauer zu analysieren, reduzieren die Forscher den Analysebereich auf50 bis 200 NanometerDieser Bereich wurde gewählt, weilDie meisten EVs liegen in diesem Bereich.AußerdemEinschränkte LSM-Detektionsfähigkeit für Partikel unter 50 nmPartikel größer als 200 Nanometer können nicht EV sein. Daher wird der Analysebereich auf50-200Nano kann andere Arten von Partikeln effektiv ausschließen und die Genauigkeit der Analyseergebnisse verbessern.
Abbildung 2 Diagramm des NTA-basierten Immunmarkering-Algorithmus
Auf der Grundlage dieses Optimierungsalgorithmus analysierten die Forscher die Daten aus den oben genannten sechs Gruppen von Proben und die Ergebnisse zeigten, dass die EV-Reinheit auf weniger als 100% zurückging.
Tabelle 2 Verhältnis zwischen Fluoreszenzfläche (FM) und Streulichtfläche (LSM) für verschiedene Proben nach Algorithmusoptimierung (SA)
Die oben genannten Algorithmen nutzen Quantenpunktmarkierung und NTA-FL-Technologie, um durch den Vergleich der Ergebnisse von Fluoreszenzmodus (FM) und Streulichtmodus (LSM) verschiedene Subtypen von EV auf der Ebene der einzelnen Veskeln effektiv zu identifizieren und zu analysieren und präzisere Korngrößenverteilungsinformationen zu liefern. Obwohl die NTA-FL-Technologie und die Optimierungsalgorithmen die Genauigkeit der EV-Subtyp-Analyse effektiv verbessern können, müssen einige Einschränkungen der NTA-Technologie im zugrundeliegenden Prinzip erkannt werden.NTA erkennt sehr kleine EV oderBreite PartikelgrößenverteilungderProben (insbesondere EV-Proben)Es gibt eine gewisse ZeitSchwierigkeitSomit, während NTA-FL-Technologie und Optimierungsalgorithmen die Genauigkeit der Korngrößenverteilung und Konzentrationsanalyse verbessern können,Technische Engpässe von NTA nicht überwundendie anschließende Algorithmusoptimierung und die FluoreszenzmarkierungsmethodeRichtige Ergebnisse auf der Grundlage der FehlerEs ist immer noch vorsichtig zu handeln, um sich nicht zu sehr auf die Daten zu verlassen, die mit dieser Technologie erzeugt werden.NanoCoulter NanokorngrößenmeterKurter-PrinzipBrechen Sie die Grenzen des optischen Prinzips und können jedes Porpartikel genau analysieren, um die Detektion eines einzelnen Partikels im wahren Sinne zu erreichen, um eine breite Partikelgrößenverteilung zu erreichen.DispersionssystemProben haben eine bessere Messwirkung. Und nicht von den optischen Eigenschaften der Probe wie der Brechungsgrad, der Lichtabsorption beeinflusst, passen die Daten nicht zu dem wahrsten Reaktionszustand der Probe.
