Autophagie als vielversprechendes Ziel für Medikamente

Autophagie und ihre Störungen wurden bei neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs gefundenSpielenDaher ist die Entdeckung neuer therapeutischer Ziele in diesem Prozess zu einer vielversprechenden medikamentösen Behandlung geworden. Autophagie ist ein regulierter Prozess, der beschädigte Proteine und Organe unter zellulärem Stress abbaut und wiederherstellt.1，2.vonDie sogenannten AutophagenBlase durchBildung einer Bimembran um die als zerstörte Zellkomponente gekennzeichnetdurchführenMontage1Die Autophagenbläschen verschmelzen sich anschließend mit dem Lysosom und übertragen ihren Inhalt zur Abbau durch die Lysosom-Hydrolyse.

Autophagie hat eine Vielzahl komplexer physiologischer und pathophysiologischer Wirkungen, wie die Anpassung an den Nährstoffhunger, die Entfernung beschädigter intrazellulärer Proteine und Organe, die Zellentwicklung, die Anti-Alterung, die Eliminierung von Mikroben, den Zelltod, die Tumorsuppression und die Antigenpräsentation2Mitochondrialspaltung ist der selektive Abbau der Mitochondrien durch Autophagie.3Der Prozess kann in der RegelmitBeseitigung von defekten Mitochondrien nach Zellschäden oder Stress.

Materialien

• PC12Menschliches Neuroblastom (ATCC）

• 384 Löcher (Greiner）

• Zyto-id ®Autophagie-Testkit (ENZO Life Sciences）

• Orange Mitochondrialfarbstoff

• Höchst 33342

• ImageXpressPico®Automatisiertes Zellbildsystem (Molekulare Geräte）

• CellReporterXpress Datenerfassungs- und Analysesoftware（Molekulare Geräte）

Vorteile

Auswirkungen quantitativer Verbindungen auf Autophagieprozesse

Teilung von Zellen mit Nuklear-Marker, Erkennung und Charakterisierung kleinerZielobjekte

Zuverlässige statistische Ergebnisse mit automatisierter Bildgebung

Erkennung und Quantifizierung von Autophagopartikeln mit automatisierter Zellbildgebung

Bewertung der Auswirkungen auf die Autophagie

In dieser AnwendungsbeschreibungWir haben es bewertet.ImageXpressPicoEffizienz von automatisierten Zellbildsystemen zur Erkennung und Quantifizierung von Autophagen-Partikeln.PC12Die menschliche Neurozytom-Zelllinie wird als Erkennungs- und Entwicklungsmodell verwendet. Zellen mit 6，000 einZellen/Löcher impfen384In der Platte, inkubieren48Stunden. Um die Auswirkungen auf die Autophagie zu bewerten,machenBehandlung von Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Chlorquin oder Velaparmi48Stunden. VillapalmikannAutophagie induziert, während ChloroquinkannUnterdrückung der Autophagobebau, die zur Ansammlung von Partikeln führt.VerbindungenNach der Behandlung verwendenZyto-id ®AutophagieprüfungKit für LebenDie Zellen werden gefärbt, umZeigeSpurenAutophagen. Darüber hinaus verwenden wir fluoreszierende Mitochondrialfarbstoffe zur Detektion von Mitochondrien und verwendenHoechstErkennung des Zellkernes (Konzentrationjeweils für 0.2 μMund 1 μM). verwendenKombination20xoder40xObjektivederImageXpressPicoSystem und drei Prüfkanäle（FITCundTRITCundDAPI）Für die ZellenBildgebung durchführen. in20xObjektiveUnter jedem Loch ein Bild zu sammeln, in40xUnter dem ObjektJedes LochSammlung2-4Bild, um zuverlässige statistische Ergebnisse zu gewährleisten. verwendenCellReporterXpressBilderfassungs- und Analysesoftware für Autophage- oder Mitochondrialanwendungen zur Analyse von Bildern.

Bild 1：Autophagen-Tests.Das obige Bild zeigtÜberAutophagisches Chlorochin (30 pM(Bearbeiten undmachenVerwendenZyto-idFarbstoff gefärbt.PC12Repräsentative Autophagen Zellen Bild und Analyse Masken. inCellReporterXpressIn der Software wird die Punktteilung verwendet, um Autophagen zu identifizieren. ZellkernZeige alsBlau, MitochondrienZeige alsOrange, AutophagieZeige alsGrün. untenBildanzeigenmachtFärbung unbehandelter Zellen mit orangefarbenen Mitochondrialintegritätsfarbstoffen.Bild- und Analysemasken für die Mitochondrialerkennung.

Diese Algorithmen könnenmitErkennung und Charakterisierung KleinZielobjektewie Autophagen oder Mitochondrien im Zytoplasma, während Kernmarker verwendet werden, um Zellen zu teilen. Quantifizierung zur Erkennung von AutophagieErkennungEnthält die Gesamtzahl oder Durchschnittszahl der Partikel, die Gesamtfläche oder Durchschnittsfläche und die Intensität der Partikel (Subzellobjekte). mit Chlorquin (30 μM(Bearbeitung)hinterRepräsentative Bilder von Zellen und analytische Masken1gezeigt. PrüfenTestenChlorquin und VelapamiZellen nach der BehandlungKonzentration der Reaktion und BewertungEG50Wert. Gesamtzahl der AutophagenDie Daten zeigen,Chloroquin und Velapami Behandlung machtZellenDie Autophagie steigt jeweils4.6Mal und3.3doppelt（EG50Der Wert ist jeweils4.0und3.6 μM).

Schlussfolgerungen

Diese Methode undZyto-idFarbstoffekombinierenEs kann zur Erkennung von Autophage-Partikeln und zur Erkennung der Auswirkungen von Entwicklungs- und Quantifizierungsverbindungen auf Autophage-Prozesse verwendet werden.

ReferenzenLiteratur

1. 1. Mizushima, N.; Komatsu, M. (2011). Autophagie: Erneuerung von Zellen und Gewebe. Zelle. 147: 728–41

2. 2. Mizushima, N.; (2007). Autophagie: Prozess und Funktion, Gene & Ent. 21: 2861-2873