„Kombination von Biosensor- und metabolischen Netzwerkoptimierungsstrategien für eine verbesserte L-Threoninproduktion invon Escherichia coliIm März 2025 veröffentlichte das Rao Zhiming-Team der Gangnam-UniversitätBiotechnologie für Biokraftstoffe und BioprodukteVorheriger Artikel. Die Studie schlägt eine Reihe von technischen Strategien vor, um die Produktionskapazität der L-Surin-produzierenden Bakterien weiter zu verbessern.

Diese Studie entwickelt nicht nur einen hochproduktiven L-Surin-Stamm mit industriellem Anwendungspotenzial, sondern zeigt auch neue Methoden zum Bau hochempfindlicher L-Surin-Biosensoren.Neue Ideen zur Entwicklung von Biosensoren für andere Chemikalien.

Um einen hochempfindlichen L-Surin-Biosensor zu entwickeln, verabreichten die Forscher MG1655 zunächst mit 0-60 g/L exonem Surin und durchführten eine transkriptomische Analyse, um 32 Gene zu untersuchen, deren Expression positiv mit Surin korreliert; Nach einem weiteren Fokus auf 21 Launcher für den Aufbau der eGFP-Berichtsbibliothek wurde bestätigt, dass die PcysK-Reaktion optimal und linear ist, aber die natürliche Komponentenschwelle schmal und falsch positiv ist, was eine weitere Optimierung erfordert.

Um die Mängel der natürlichen Sensorempfindlichkeit mit engen Schwellen zu überwinden, wurden künstliche Modifikationen der Starter-Serie "cys" durchgeführt:

Im Vergleich zu bestehenden Systemen ist das Fehlerrisiko bei pSensorThr gering, aber der Reaktionsbereich ist immer noch eng und der Reaktionsbereich muss weiter optimiert werden, um die Anwendbarkeit zu erweitern.

Import des temperaturempfindlichen Mutationsplasmids MP6ts in THR36-L19, Mutation bei 30 °C, Desplasmidierung bei 42 °C, schneller Aufbau einer massiven Mutationsbibliothek; Anschließend wurde pSensorThr eingeführt und mit FACS und QPix High-Flow-Screening-Geräten fünf Runden des „Mutation-Screening“-Zyklus durchgeführt, um insgesamt 50 hochproduktive fluoreszierende Mutationsstämme auszuwählen. Die Schüttelflaschenvalidierung zeigte, dass die meisten Stämme eine bessere Ausbeute als die Ausgangsbakterien hatten, wobei THRM1 mit 38,97 g/L die höchste Ausbeute hatte.

Die hohe THRM1-Ausbeute stammt aus den Mutationen "Tpx C61G" und "SpoT R290H → H290R-Antwort": eine Steigerung der Ausbeute um ≈ 3%. Darüber hinaus, Knock tpx oder spoT jeweils geringfügige oder starke Reduzierung der Produktion, bestätigen die Wirkung beider. Die übrigen vier Mutationen leisteten keinen signifikanten Beitrag. Die Transkriptionsgruppe zeigt, dass THRM1 den Kohlenstoffstrom neu reguliert: EMP und Acetalsäure-Wege nach oben reguliert, TCA nach unten reguliert, PPS-hohe Expression ergänzt PEP; Aber die Überexpression von pykF, poxB und pflB verursacht Kohlenstoffverlust. Durch die Ablösung dieser drei Gene stieg die THRM6-Produktion auf 41,36 g/L. Diese Erkenntnisse identifizieren wichtige genetische Ziele und geben eine Orientierung für eine weitere Steigerung der Erzeugung.

FBA basiert auf dem iML1515-Modell und prognostiziert gemeinsam mit OptKnock, um zwei Produktionssteigerungswege festzustellen und zu validieren:

Flaschenhals der Amino-Versorgung- Simulation zeigt, dass der gdhA-Durchfluss erhöht werden muss; Durch den Aufbau einer RBS-Bibliothek wurde die GdhA-Expression fein reguliert und die THRM7-Ausbeute auf 44,12 g/L erhöht.

Nebenproduktion / Externe Genknock-out- Kombination des erweiterten GSMN mit OptKnock zur Vorhersage von ydbK, ompN, aroL, phoA und puuE 5 Genknockout-Ziele, die experimentell bestätigt haben, dass ompN-Knockout und phoA-Knockout effektiv für die Stammenproduktion sind; Die THRM13-Shaker nach der Kombination lieferte 46,02 g/L, 5 L Dosen Ergänzungen wurden partiell fermentiert bis zu 163,2 g/L, eine Rate von 0,603 g/g Glukose, der Rekord für E. coli L-Surin berichtet. Die Forschung lieferte eine systematische Strategie für die nachfolgende hohe Erträglichkeit von Asparaginsäure-Derivaten.

In dieser Studie wurde ein Biosensor mit hoher Empfindlichkeit und hoher Fluoreszenzschwelle entwickelt, der für das Screening ausgezeichneter Mutationsstämme auf Plattformen mit hohem Durchsatz verwendet wird.Durch polyomische Analysen geführte Reverse Metabolic Engineering und Computersimulationen erreichte der technische Stamm THRM13 eine L-Tyroninproduktion von 163,2 g/l in einem 5-L-Fermentationsbehälter mit einer Zuckersäureumwandlungsrate von 60,3%, das bisher höchste Niveau, das ohne exone Induktoren und Antibiotika berichtet wurde. Darüber hinaus kann diese hohe Durchsatz-Screening-Strategie weiterhin für die nachfolgende iterative Evolution von Stämmen verwendet werden.

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