Um dieses Problem zu lösen, hat das Entwicklungsteam eine multimodale Fluoreszenz-Bildgebungsplattform entwickelt, die ein Breitfeld-Fluoreszenz-Navigationssystem (WF-Nav) mit einer miniaturisierten Doppelphotonen-Mikrobildgebung und einer miniaturisierten Drei-Photonen-Mikrobildgebung integriert. Um die Vorteile der Einzelphotonen-Anregung voll auszuschöpfen, verfügt das WF-Nav-System über große Sichtfeld- und Einzelzellauflösungsfunktionen, um bestimmte Interessengebiete schnell zu erkennen. Sobald das System den Zielbereich erreicht hat, kann es nahtlos auf eine Doppel- oder Drei-Photonen-Bildgebung umschalten, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis oder eine tiefe Neuronenbildgebung zu erreichen. Anschließend wird die m2PM- oder m3PM-Sonde an den Mauskopf befestigt und die Maus für die freie Bewegung der Bildgebung freigegeben.

Abbildung 1. Konstruktion eines multimodalen fluoreszierenden Bildgebungssystems

Das WF-Nav-System besteht aus einem multifarbigen Breitfeldmikroskop mit großem Sichtfeld und einem multifunktionalen Adapter. Das System verwendet drei LEDs als excitierende Lichtquelle (405nm, 473nm, 561nm) und ist mit einer nicht-sphärischen Fokusslinse mit hoher numerischer Apertur ausgestattet, um den LED-Strahl geradlinig zu machen, wobei jeder excitierende Lichtweg mit einem entsprechenden Filtersatz ausgestattet ist. Um eine große Sichtfeld-Navigation zu ermöglichen und genügend Platz für den nahtlosen Umschalt von Multi-Photon-Spiegelsätzen zu bieten, hat das Entwicklungsteam ein trockenes Objektiv mit langer Arbeitsdistanz und niedriger Vergrößerung entwickelt. Das Objektiv (3,3x) ist mit einem Anti-Teleskopie-Design ausgestattet: Die Vorderseite liefert eine negative Lichtintensität für zwei geklebte, doppelte Linsen, während die Rückseite aus einer einzigen sphärischen Linse besteht. Diese Struktur verschiebt die Hauptebene nach hinten, um die Farbdifferenz zu korrigieren, erzielt einen sehr langen effektiven Brennabstand, während die numerische Apertur beibehalten wird, und erreicht schließlich den bahnbrechenden Indikator für einen Arbeitsabstand von 90 mm und erreicht das maximale Bildfeld von Φ5,64 mm.

Abbildung 2. Widefield Fluorescence Microscope Design

Um einen nahtlosen Wechsel zwischen dem Breitfeldmodus und dem Multiphotonenbildmodus zu ermöglichen, hat das Team einen Multifunktionsadapter entwickelt. Der Adapter verbindet Breitfeldobjektive und regelt die Brennweite auf der elektrischen Z-Achse-Plattform. Durch das standardisierte m2/3PM-Sondenentwurf kann die Sonde fest auf dem gleichen Halter montiert werden und garantiert eine gleichfokussierte Bildgebung beim Wechsel zwischen dem Multiphotonen- und dem Breitfeldmodus.

Abbildung 3. Multifunktionsadapter und Zig-Fokus-Funktion

Dieses Objektiv mit einem Arbeitsabstand von 90 mm bietet ausreichend Platz für die Bedienung von Bauteilen, Fasern oder abnehmbaren elektrischen Zoom-Objektivmodulen. Die Bauteilhalterung ist auf einer leichten, geradlinigen Kugelschiene mit einem minimalen Gleitwiderstand (ca. 0,1 N) und einem Zugabstand von 12 mm montiert, um die Kollisionsgefahr zwischen Objektiv und Probe effektiv zu vermeiden. Durch den Austausch der Kopfhalterhalter ist das System kompatibel mit verschiedenen Kopfhaltern wie mini2P und m3PM. Darüber hinaus bietet das System dank der Größe und des zurückziehbaren Designs des miniaturisierten Doppelfotonmikroskops im Vergleich zu herkömmlichen Tischobjektiven einen größeren Beobachtungswinkel in den meisten Richtungen, was zu einem größeren Beobachtungsbereich der Probe führt. Dieses Design verbessert die grobe Positionierungseffizienz der Probe erheblich.

Abbildung 4. Vergleich zwischen verschiedenen Objektiven und den Beobachtungswinkeln des miniaturisierten Doppelfotonmikroskops

Als nächstes bewerteten die Entwickler die optischen Eigenschaften und die praktischen Anwendungen des Breitfeldfluoreszenzmikroskops. Die Bildgebung von Hirnschieben von Thy1-YFPH-Mäusen ermöglichte die eindeutige Identifizierung von Neuronen und Axonen. Eine lebende Kalziumionenbildgebung unter 470 nm Wellenlänge und eine morfologische Bildgebung unter 561 nm Wellenlänge ergab erfolgreich 3804 GCaMP6f-markierte Neuronen und 4650 Maus-Astrozyten, die mCherry ausdrücken. Diese Ergebnisse beweisen, dass das Breitfeldmikroskop eine Vielfarbigkeit, eine einzigzellige Auflösung und eine hohe Durchsatzbildgebung bietet und eine ausgezeichnete Leistung für die Navigation in Zielregionen von Interesse bietet.

Video 5. Miniaturisiertes Breitfeldmikroskop mit hohem Durchsatz

Um die m2PM-Bildgebung bei freien Mäusen reibungsloser zu gestalten, haben die Entwickler einen standardisierten Bildgebungsprozess entwickelt, um die Effizienz der m2PM-Bildgebung bei freien Tieren zu verbessern. Zunächst werden Virusinjektionen und chirurgische Eingriffe wie ein kraniales Fensterimplantat oder ein GRIN-Lens-Implantat durchgeführt, anschließend warten Sie 2-4 Wochen, um sicherzustellen, dass sich das Virus ausreichend ausdrückt und sich die chirurgische Verletzung erholt. Nehmen wir zum Beispiel ein Experiment, in dem wir GCaMP6s und mCherry in den Neuronen der primären motorischen Kortes (M1) markierten und die Mäuse anschließend an einem Laufband unter dem WF-Nav-Gerät befestigten. Anschließend positionieren Sie das Interessengebiet des Ziels mit einem Breitfeldmikroskop und richten Sie es auf das Zentrum des Sichtfeldes aus. Anschließend wechseln Sie über den Adapter in den m2PM-Modus, um eine bifarbige biphotonische Bildgebung bei 920 nm und 1030 nm Wellenlängen durchzuführen und schließlich die feine Anpassung der XY-Achse und der Fokusebene durchzuführen, um den endgültigen Zielbereich innerhalb weniger Minuten zu bestätigen. In den meisten Fällen wird die Zielfokusebene um etwa 25 µm erhöht, um die durch die Zementkontraktion verursachte Fokusverschiebung zu kompensieren, und die Baseplate wird an den Kopf des Tieres befestigt, um nach etwa 10 Minuten der Aushärtung eine freie Bewegungsbilderung durchzuführen.

Abbildung 6. Standardisierter Mikro-Doppelfotonen-Mikrobildprozess mit freier Aktivität

Die Entwickler haben das System durch Bildgebung von Kalziumsignalen und Strukturen von Neuronen in sozialen Experimenten mit Mäusen validiert, und der gesamte Installationsvorgang dauerte etwa 20 Minuten mit einer Erfolgsquote von bis zu 100% (n = 15), die auch unerfahrene Forscher leicht beherrschen konnten, was die Experimentaleffizienz erheblich verbesserte. Darüber hinaus wurden mehrtägige wiederholte Bildgebung von Schicht 2-Neuronen und Astrozyten in der M1-Zone durchgeführt und die Ergebnisse zeigten, dass die Sichtfeldzuordnung stabil war, ohne die Baseplate neu zu installieren.

Abbildung 7. Mehr Tage gleiches Sichtfeld

Dank der standardisierten mechanischen Konstruktion kann der m3PM-Bildkopf einfach an den Halter montiert werden. Verwenden Sie einen multifunktionalen Adapter, um nahtlos vom Breitfeldmodus auf den Drei-Photonen-Bildmodus zu wechseln. Aufgrund der begrenzten Tiefe der Breitfeld-Einphotonenmikroskop-Bildgebung sind tiefe Signale oft schwer zu erkennen; Obwohl oberflächliche Blutgefäße als Bezugspunkt dienen können, bietet die Behaltung der Virusinjektionszone auf der Oberfläche eine direktere Fluoreszenzmarke, die dazu beiträgt, tiefere Stellen auf der vertikalen Achse auszurichten. Bei Mäusen, die GCaMP6f an den Kopf festhielten und ausdrückten, konnten die Entwickler erfolgreich die neuronale Aktivität in der Postubiculum-Region in einer Tiefe von 1020 μm von der Oberfläche der Kortex aufzeichnen und ein Experiment zur Exploration des absenten Verhaltens bei Mäusen durchführen, um die langfristige Kalziumsignalaktivität in einer Tiefe von 670 μm aufzeichnen zu können.

Abbildung 8. Miniaturisierte Drei-Photonen-Fixierung und freies Verhalten Bildgebung

Diese Arbeit wurde von Professor Wu Runlong von der Pekinger Universität für Informationswissenschaften (Kommunikationsautor), Professor Wang Aimin von der Pekinger Universität und Professor Cheng Heping durchgeführt.

[Referenz]

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Breitfeld-Fluoreszenz-Navigationssystem für effiziente Miniatur-Multiphoton-Bildgebung bei frei verhaltenden Tieren. Neurophotonik. 2025; 12(2):025018. Doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018