Menschliche SV40-Transfektion in Knochenzellen HFOB1.19 (STR)

Menschliche SV40-Transfektion in Knochenzellen HFOB1.19 (STR)Aufbaubedingungen

Zwei,Nachlieferung

Erholungszellenbehandlung:Füllen Sie die Kulturflüssigkeit und verschließen Sie die Flaschenmünde nach der Kultivierung in gutem Zustand ist die beste Möglichkeit, Zellen zu transportieren. Empfangen der Zellen mit 75% Alkohol gesprühtZellflaschen,Streng sterilhinterLassen Sie die Zellflasche 2-4 Stunden in der Kultivkammer stehen, um den Zellstand zu stabilisieren. Nachdem das Mikroskop das Zellwachstum beobachtet und die Zellen in verschiedenen Vielfachen fotografiert werden (am besten 40x, 100x, 200x jeweils), sind die ersten drei Tage Fotos eine wichtige Nachverkaufsgrundlage, keine Standardfotos erhalten in gutem Zustand.

Verfahrensweise zur Zellbehandlung:Nach dem Empfang der Zellen, beobachten Sie, ob es Trockeneis in der Schaumstoffkaste gibt, ob das Gefrierrohr intakt ist oder nicht, wenn es eine Auffrierung gibt, wenn Trockeneis verdampft oder das Gefrierrohr ein Auffrierungsschäden hat, bitte rechtzeitig ein Foto aufnehmen und uns kontaktieren. Wenn die Zelle sich nicht innerhalb von drei Tagen nach der Unterzeichnung mit uns in Verbindung setzt, wird die Lieferung standardmäßig als gut empfangen angesehen. Erholung der ersten Röhre Wenn es Probleme mit der Aktivität gibt, kontaktieren Sie uns bitte rechtzeitig, der Techniker kommuniziert mit Ihnen, um die Anleitung zu erhalten, bevor Sie die zweite Röhre erholen,Nicht mit uns in Verbindung zu treten, wenn es zu Problemen mit der Wiederherstellung der zweiten Rohre nicht nach dem Verkauf.

Schritte der Zellkultur

und a,ZellenübertragungWenn:Wenn die Konvergenz nicht mehr als 80% ist, sammeln Sie die in Flaschen gefüllte Kultur in ein Zentrifugerrohr, lassen Sie 5 ml Medium zurück und geben Sie 37 ° C, 5% CO₂Inkubationskastenkultur; Wenn die Zelldichte 80% übersteigt, kann eine Übertragungskultur durchgeführt werden.

WandzellenDie Schritte sind wie folgt:

1) Entfernen Sie die Kultur und waschen Sie die Zellen 1-2 mal mit PBS, das keine Kalzium- und Magnesiumionen enthält;

2) Fügen Sie 1 ml Verdauungsflüssigkeit (0,25% Trypsin-0,53 mM EDTA) in der Kultivflasche hinzu, verdauen Sie 1 min in der Kultivkammer und beobachten Sie dann die Zellverau unter dem Mikroskop, wenn die meisten Zellen sich runden und abfallen, nehmen Sie schnell den Arbeitstisch zurück, klicken Sie auf die Kultivflasche nach ein paar Minuten, fügen Sie 6 ml Serum mit 10%KulturmediumBeendigung der Verdauung;

3) sanft schlagen die Zellen, nach dem Abfallen in das Zentrifugerrohr, 1000 rpm Zentrifuge 5-8min, entfernen Sie die Oberflüssigkeit, 1-2mL Medium nach dem Zusatz blasen;

4) Die Zellsuspension wird in einem Verhältnis von 1: 2 in eine neue 6-cm-Petrischale mit 5-6 ml Medium oder in eine T25-Flasche aufgeteilt, indem Sie 5-6 ml pro Flasche zusätzliches Medium hinzufügen.

(d.h. 1 T25-Flasche wird in 2 T25-Flaschen oder 2 6 cm große Petrischalen übertragen)

Suspendierte ZellenDie Übertragungsschritte sind wie folgt:

1. Halbtauschmethode

Halbwechselbehandlung, vertikale Flasche in der Kultivkammer für etwa 1 Stunde, sanft saugen Sie das Medium von etwa 3 ml ab und versorgen Sie dann das Medium von 3 ml, wenn das Medium langsam verfärbt wird, können Sie direkt etwa 500 ul FBS hinzufügen, wenn die Übertragung 5 ml Medium direkt versorgen kann.

2. Zentrifugalwechsel

Wenn Sie die Zellsuspension in 1000 rpm in der Zentrifugeröhre sammeln möchten, 5 min zentrifugieren, den oberen Reinigungsmittel entfernen, 1-2 ml Kultur hinzufügen und die Zellsuspension im Verhältnis von 1: 2 in die neue T25-Flasche aufteilen, 6-8 ml hinzufügen, das neue Medium gemäß den Anforderungen der Anleitung konfiguriert ist, um die Wachstumsleistung der Zelle aufrechtzuerhalten, und die nachfolgende Übertragung erfolgt im Verhältnis von 1: 2 ~ 1: 5 nach den tatsächlichen Umständen.

b undGefrierte Zellen:

1, wenn die Zellen wachsen, um 80% der Fläche der Kulturflasche zu bedecken, werfen Sie die Kulturflüssigkeit in der T25-Flasche ab und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS;

2, fügen Sie 0,25% Verdauungsflüssigkeit etwa 1 ml in die Kulturflasche hinzu, beobachten Sie es unter dem umgekehrten Mikroskop, fügen Sie 5 ml Verdauungsflüssigkeit hinzu, um die Verdauung zu beenden, und schlagen Sie die Zellen leicht ab, dann übertragen Sie die Suspension in ein 15 ml Zentrifugerrohr, 1000 Umdrehungen pro Minute Zentrifuge für 5 Minuten;

3. Entfernen Sie das obere Serum und fügen Sie den Niederschlagszellen 1 ml Yagi Bio Serum-freies Gefriermittel (Warennummer: C7001) hinzu und mischen Sie es nach dem Gefrierrohr.

Die gefrorenen Zellen können direkt in den Kühlschrank von -80 ° C gelegt werden, wenn die Zellen später in einen flüssigen Stickstofftank übertragen werden sollen.Kühlschrank bei -80°C erforderlichMitteLagerung über 24 StundenIn den flüssigen Stickstoff-Tank übertragen.

C undZellresultation:

1. Entfernen Sie das Zellfrierrohr aus flüssigem Stickstoff (beachten Sie den Tragschutz)Maske) schnell zu setzen. Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad, bis es keine Kristalle im Gefrierrohr gibt und die Außenwände des Gefrierrohrs mit 75% Alkohol wischen;

2、Verschieben der Zellen in den Gefrierrohren in die 5ml Medium in 15ml Zentrifugerrohr, 1000rpm Zentrifuge 5min;

3、Entfernen, Niederschlag mit 5 ml Medium wieder suspendieren, ImpfungIn die T25-Kulturflasche setzen.bei 37 °C, 5 % CO₂Kultur in Zellkultur;

Am nächsten Tag wechseln Sie mit frischem Kulturmedium weiter.

Hinweis:Einige Zellen sind nicht fest an der Wand fest, während des Transports kann es leicht zu Zellalfall kommen, was ein normales Phänomen ist. Wenn die Entfernung größer ist, kann die Kulturflasche alle Kulturflüssigkeit in das Zentrifugerrohr sammeln, 1000 rpm Zentrifuge 5min,SammelnÜbergangskultur(Später Vergleich)Die Fällung wird 1-2 ml hinzugefügt, leicht geblasen, wieder suspendiert, 1-2 Minuten nach der Verdauung, 5 ml Medium hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden. Noch einmal zentrifizieren, die Reinigung abwerfen und 1-2 ml Medium wieder suspendieren. Dann in einem Verhältnis von 1: 2 in Flaschen übertragen (zwei T25), das neue Medium auf 5-8 ml / Flasche ergänzen und schließlich in37 ℃, 5% CO₂Zellkultur in einer Zellkultur.

Neue und alte Kunden sind willkommen:Menschliche SV40-Transfektion in Knochenzellen HFOB1.19 (STR)