(Experimentelle Dienstleistungen) Echtzeit-fluoreszierende quantitative PCR

1. Service Übersicht

(Experimentelle Dienstleistungen) Echtzeit-fluoreszierende quantitative PCRQuantitative Real-time PCR (qPCR) bezieht sich auf eine Methode, mit der Fluoreszenzgruppen in ein PCR-Amplifikationssystem hinzugefügt werden, der den gesamten PCR-Prozess in Echtzeit mit der Akkumulation von Fluoreszenzsignalen überwacht und schließlich eine quantitative Analyse unbekannter Vorlagen über Standardkurven durchführt. Als „Goldstandard“-Technik in der molekularen Biologie ist qPCR mit seiner Sensitivität, Spezifikation und Genauigkeit zum Werkzeug für die Genexpressionsanalyse, die Erkennung von Pathogenen und die Untersuchung genetischer Variationen geworden.

Wir setzen auf eine PCR-Testplattform, umNukleinsäureextraktion, Retroskription, qPCR-Erweiterung zur DatenanalyseOne-Stop-technischer Service. Ob Sie mRNA-, miRNA- oder lncRNA-Expressionsniveaus prüfen oder eine DNA-Kopienzahl-Variationsanalyse (CNV) durchführen möchten, wir bieten Ihnen qualitativ hochwertige Daten, die Ihren Standards entsprechen.

2. Technische Prinzipien und Methoden

Wir bieten zwei gängige Prüfstrategien an, die unterschiedlichen Anforderungen des Experiments gerecht werden:

• SYBR Green I Farbverfahren:

• Grundsatz:Der Farbstoff SYBR Green I bindet spezifisch zu kleinen Spalten der doppelkettigen DNA und verstärkt das Fluoreszenzsignal nach der Bindung. Mit zunehmendem PCR-Produkt wird das Fluoreszenzsignal synchron verstärkt.

• Anwendung:Erste Untersuchungen für Differenzen in der Genexpression, Massenprobentests, kostensensitive Projekte. Wir arbeiten mit der Melt Curve-Analyse zusammen, um die Einheit des Verstärkungsprodukts zu gewährleisten.

• TaqMan-Sondenmethode:

• Grundsatz:Verwenden Sie spezifische Sonden, die für die Zielsequenz konzipiert sind (5'-End-Markierte Fluoreszenzberichtsgruppe, 3'-End-Markierte Löschgruppe). Die Sonde ist vollständig ohne Fluoreszenz und die Hydrolyse des Taq-Enzyms während der Amplifikation trennt die Fluoreszenzgruppe und emittiert Fluoreszenz.

• Anwendung:Die hohe Spezifizität erfordert Experimente, Multiplex-PCR, SNP-Typierung und Spurprobentest.

Service und gesamter Prozess

Wir befolgen strikt die Standardisierten Betriebsprozesse (SOP), um sicherzustellen, dass jeder Schritt genau kontrolliert werden kann:

Phase 1: Experimentale Konstruktion und Optimierung

• Protokoll/Sondenentwurf:Cross-Endogene-Protokolle für das Zielgen (Target Gene) zu entwerfen, um eine DNA-Verschmutzung des Genoms zu vermeiden; Screening von Housekeeping Genen wie GAPDH, ACTB, 18S rRNA etc.

• Prüfung vor dem Experiment:Überprüfung der Prototerspezifizität durch gewöhnliche PCR- und Gelelektrophorese zur Optimierung der Brenntemperatur.

Phase 2: Probenbehandlung

• Nukleinsäureextraktion:Für verschiedene Probentypen (Zellen, Gewebe, Blut, Exosomen usw.) werden hochwertige GesamtRNA oder DNA mit speziellen Kits extrahiert, um die Konzentration und Reinheit (OD260/280) zu prüfen und die Integrität zu bewerten.

• Reverse Transkription (cDNA-Synthese):Verwendung von Oligo(dT) oder zufälligen Prototypen gegen mRNA; Verwenden Sie die Stengelring-Initiator- oder Endmethode für miRNA, um eine gleichmäßige Transkriptionseffizienz zu gewährleisten.

Phase 3: Überprüfung

• Systemaufbau:Konfigurieren Sie ein hochfidelitäres qPCR-Reaktionssystem und setzen Sie mindestens 3 technische Triplikate ein, um Probenfehler zu beseitigen.

• Programm läuft:Erfassung von Fluoreszenzsignalen in Echtzeit und Erzeugung von Verstärkungskurven.

Phase 4: Datenanalyse

• Relative Quantisierung:Anwendung2−ΔΔCtDie Methode berechnet die Unterschiede in der Genexpression in der experimentellen Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe Fold Change.

  
  

• Quantifizierung:Erstellen Sie Plasmid-Standards, zeichnen Sie Standardkurven und berechnen Sie die genaue Anzahl der Kopien der Zielgene in der Probe.

  
  

4. Unsere Hauptvorteile

1. Hardware-Plattform:Mainstream-quantitativer PCR-Messgerät, sehr geringe Porendifferenz und hohe Datenstabilität.

2. Strenges Qualitätskontrollsystem:Folgen Sie internationalen MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments） Leitlinien. Die Verstärkungseffizienz (90%-110%) und die lineare Beziehung (R² > 0,99) werden streng überwacht, um falsch positiv / falsch negativ zu sein.

3. Komplexe Probenbehandlung:Wir verfügen über umfangreiche Erfahrung in der Verarbeitung von FFPE-Schnitten, Spurgewebe, Exosomen und Vollblutproben, um PCR-Inhibitoren effektiv zu entfernen.

4. Professionelle Datenlieferung:Nicht nur die ursprünglichen Ct-Werte, sondern auch Amplifikationsdiagramme, Schmelzkurven, Säulendiagramme/Wärmediagramme für den relativen Ausdruck und die Erstellung eines vollständigen Berichts mit detaillierten experimentellen Materialien und Methoden, um die Publikationsanforderungen von SCI direkt zu erfüllen.

5. Anwendungsszenarien

• Analyse des Niveaus der Genexpression:Validierung der differenziellen Expression von mRNA, lncRNA und circRNA unter verschiedenen Behandlungsbedingungen oder Krankheitsmodellen (qPCR-Validierung nach RNA-Seq).

• MiRNA-Tests:Studien zur Regulierung der Expression von Mikro-RNA.

• Variation der DNA-Kopienzahl (CNV):Detektion von Tumorgenen, die sich vergrößern oder fehlen, und Identifizierung der Anzahl der genetisch veränderten Kopien.

• SNP-Verifizierung:Genotypisierung von Single-Nukleotid-Polymorphie-Standorten.

• Pathogene mikrobielle Tests:Viruslastmessung, qualitative und quantitative Analyse von Bakterien.

• Die ChIP-qPCR:Die Anreicherung der DNA-Fragmente nach der Chromatin-Immunfällung wurde verifiziert und die Protein-DNA-Wechselwirkungen untersucht.

6. Probenanforderungen und Lieferstandards

• Vorschläge zur Probenvergabe:

• Zellen: Zellfällung >

• 1*10^6， PBS nach Reinigung gefriert.

• Organisation:Tiergewebe > 50 mg, pflanzliches Gewebe > 100 mg, flüssiger Stickstoff oder RNAlater aufbewahren

• Blut:Vollblut erfordert eine Antikoagulationsbehandlung oder eine direkte Bereitstellung des isolierten Serums / Plasmas.

• RNA und DNA:Konzentration > 50ng / μL, Gesamtmenge > 1μg, Trockeneis Transport.

• Lieferung:Kompletter Versuchsbericht (mit Versuchsschritten, Reagenzinformationen), Rohdatendateien (.eds/.xls), Datenanalyse-Ergebnisdiagramme (Excel-Tabellen und HD-Bilder).