pBLUE-T Simple Carrier Quick Cloning Kit T4 Prinzipien

pBLUE-T EinfachTräger-Schnellklon-Kit

pBLUE-T Simple Carrier Quick Cloning Kit T4 Prinzipien

Katalognummer:42119

Zusammensetzung, Lagerung und Stabilität:

- Lagerung bei 20 ° C, die Wirkung der Verwendung innerhalb von 6 Monaten nicht beeinflussen.

Produktbeschreibung:

pBLUE-T Simple Vector ist ein spezieller Träger für die effiziente Klonierung von PCR-Produkten (TA Cloning). Dieser Träger wird von pBlueScript II SK(+) Plasmoden modifiziert, und im Gegensatz zu der herkömmlichen T-Träger ECOR V-Schnitt-und-T-Methode, pSURE-T Simple erzeugt unmatched T-Basen direkt an den 3 ′ Enden beider Seiten der Original-Polyklon-Stelle nach der Einführung des Xcm I-Enzymschnitts an der Original-Polyklon-Stelle durch die Modifizierung des pBlueScript II SK(+), wodurch eine höhere Rekombinationseffizienz erzielt wird. Gleichzeitig eliminiert es polyklonale Enzym-Schnitte auf pBlueScript II SK(+)-Trägern, die geeignete Enzym-Schnitte auf PCR-Amplifikationsprimern importieren müssen. Wenn Sie zu diesem Zeitpunkt die DNA-Enzyme-Schnittstelle verwenden, die von PCR-Amplifikationsprimern importiert wurde, wird die Enzyme-Schnittreaktion nicht von Restriktionsenzymen an anderen polyklonalen Enzyme-Schnittstellen auf dem T-Träger beeinflusst, was die Enzyme-Schnitteffizienz erheblich verbessern und die Subklonerfolgsrate erhöhen kann. Darüber hinaus verfügen unsere Trägerverbindungssysteme über geringen Hintergrund (weniger als 10% der blauen Flecken), eine hohe Rekonstruktionsrate (über 90% der weißen Flecken haben Einsetzsegmente) und eine schnelle Verbindung. Die technischen Daten zu den pBLUE-T Simple-Trägern sind am Ende dieser Beschreibung aufgeführt, deren vollständige Sequenz auf die pBlueScript II SK(+)-Sequenz verweisen kann, allerdings ist die Sequenz der polyklonalen Enzyme-Lokalisierung etwas anders.

Sequenzierung empfohlen mit M13 Universal Sequencing Primer und T3 Starter Subprimer (siehe Diagramm unten)
Betriebsschritte:
1. Vorbereitung der Verbindungsreaktion

Ob ein PCR-Produkt gereinigt werden soll, hängt von der Qualität des amplifizierten Produkts ab. Wenn das PCR-Produkt sehr sauber ist, kann eine direkte Verbindungsreaktion ohne Reinigung durchgeführt werden. Doch wenn es sich um ein Plasmid-Vorlage PCR-Produkt handelt, muss es gereinigt werden, und das Vorlage Plasmid kann auch weiße Flecken bilden. Die PCR-Produkte können durch die Elektrophorese von Aginogel isoliert werden. Die von uns hergestellten Schnellreinigungsrecycling-Kits für DNA-Produkte können DNA-Fragmente über 70 bps gut recyceln.

Taq, Tth, AmpliTaq und KlenTaq DNA-Polymerase-amplifizierte PCR-Produkte, die alle mit einem hervorragenden 3’ Ende versehen sind-A. mit 3“-Das PCR-Produkt am A-End kann direkt mit dem pBLUE-T Simple-Träger geklont werden. Haben Sie 3'®Das PCR-Produkt, das durch die DNA-Polymerase (Hypophylase) verstärkt wird, die 5'-Ectase-Aktivität aufweist, ist flach-endend. Um dieses flach-endende PCR-Produkt zu klonen, sollte zuerst 3'--Arbeit mit A.

2. Regelmäßige Verbindungsreaktionen:

1) In einem Standard von 10ml Verbinden Sie das Reaktionssystem, fügen Sie 1mL 30% von pblue-t einfachml PCR-Produkt (unter normalen Bedingungen ist es nicht notwendig, das PCR-Produkt genau zu quantifizieren, das molare Verhältnis des allgemeinen PCR-Produkts zu dem Träger auf 2: 1 bis 10: 1 zu optimieren, um gute Ergebnisse zu erzielen, empfohlen 3: 1), 1ml 10´Ligation Buffer und 0,5-1m1 (2,5 -5 Weiss Einheiten) T4 DNA Ligase, der Rest mit Wasser ergänzt. Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden System:

In der Regel wird die T4 DNA Ligase hinzugefügt.

2) 16 ° C Verbindung über Nacht (in der Regel kann in einem PCR-Instrument abgeschlossen werden).

Normalerweise wird eine Übernachtungsverbindung bei 16 ° C empfohlen (10ml Die Standard-Konnektormenge des Systems beträgt 2,5 Weiss-Einheiten), um den größten Umrichter zu erhalten. Allerdings kann dieses System, das PEG Enhancer enthält, die Verbindungseffizienz mehrmals erhöhen, bei hohen Verbindungsenzymen (10mDas System empfiehlt eine Verbindungsdose von 5 Weiss-Einheiten) bei 16 ° C für 30 Minuten, um die Anforderungen der allgemeinen Studie zu erreichen.

3) Auf Eis abkühlen und dann umwandeln oder bei -20 ° C lagern.

3. Schnelle Verbindungsreaktion:

1) Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden System:

In der Regel wird die T4 DNA Ligase hinzugefügt.

2) Verbinden Sie bei 22 ° C für 5-10 Minuten (in der Regel kann in einem PCR-Instrument durchgeführt werden).

2 ´Der Quick Ligation Buffer enthält bereits alle optimierten Schnellverbindungskomponenten und wird normalerweise empfohlen, eine Verbindung bei 22 ° C für 10 Minuten (10ml Die Systemverbindungsdose beträgt 5 Weiss-Einheiten, die lange Fragmentverbindung kann auf 30 Minuten verlängert werden) kann in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erzielen. Darüber hinaus kann das System auch 30 Minuten bei 16 ° C angeschlossen werden (10ml Systemverbindungsenzyme von 5 Weiss-Einheiten) erfüllen die allgemeinen Anforderungen der Studie.

3) Auf Eis abkühlen und dann umwandeln oder bei -20 ° C lagern.

4. Umwandlung:

bei 50-100ml Gefühl Zustand Zellen, auf Eis gelegt, Wan vollständig aufgefroren, um die Zellen gleichmäßig suspendieren mehrere Male leicht schütteln.

bei Beitritt 4-5ml Verbindungsflüssigkeit (kann maximal vollständig hinzugefügt werden, solange das Volumen nicht mehr als 1/10 des Volumens der empfindlichen Zellen ist), leicht vermischen. 30 Minuten auf Eis lassen. 42 ° C Wasserbad heiß für 90 Sekunden. 2-3 Minuten auf Eis lassen.

bei Plus 500mLB oder SOC-Medium (ohne Antibiotika), Oszillationskultur bei 37 ° C bei 150 rpm für 60 Minuten.

bei wird 200ml Bakterien beschichtet im Voraus mit 16m50 mg/ml IPTG und 40ml 20 mg/ml auf X-gal beschichteten Tabletten.

Die Dosierung der beschichteten Bakterien wird entsprechend der Effizienz der Verbindung und der Empfindlichkeit der empfindlichen Zellen angepasst, wenn die erwartete Klonierung weniger ist, kann ein Teil der Kulturflüssigkeit nach Zentrifugierung (4.000 Umdrehungen pro Minute, 2 Minuten) abgezogen werden, die ausreichende Menge an Mediumsuspension der Bakterien nach der Entnahme der gesamten oder in angemessener Menge in einer Platte beschichtet werden (die restlichen beschichteten Bakterien können bei 4 Grad aufbewahrt werden, am 2. Tag, wenn die Anzahl der konvertierten Kolonien gering ist, können die restlichen Bakterien auf eine neue Platte beschichtet werden).

bei Die Tablette wird 1 Stunde bei 37 ° C nach vorne gelegt, um zu viel Flüssigkeit aufzunehmen, und die Umkehrkultur wird über Nacht durchgeführt.

5 Filtern:

1). Blau-Weiß-Filter des Konverters:

Wenn ein exones DNA-Fragment in pBLUE-T Simple eingefügt wurde, veränderte sich die Codierung des LacZ-Gens aufgrund der Nukleinsäuresequenz der exonen DNA und beeinflusste damit das Produkt.b-Halbalaktosidasea-Die Aktivität des Fragments und somit der rekombinierte Klon ist auf der X-gal/IPTG-Platte weiß, anstatt der rekombinierte Klon blau dargestellt. Manchmal ist das Einfügen von Fragmenten nicht beeinflusst lacZ-Gen-Lesefach, oder das Einfügen von Fragmenten ist zu klein, in diesem Fall Kolonien (Rekombinierte Klone) hellblau oder hellblaue Flecken im Zentrum der Kolonie mit äußeren Kreisen weiß (Fisheye blaue Flecken). Wählen Sie eine weiße Kolonie oder eine hellblaue Kolonie, die auf IPTG/X-gal-Tabletten wächst, wählen Sie mit Zahnstiften ein flüssiges Medium aus, das Ampicillin su enthält, und kultivieren Sie es über Nacht bei 37 ° C.

2). Identifizierung des Konverters:

a. Extrahieren Sie das Plasmid mit den Bakterien der oben kultivierten weißen Kolonie, schneiden Sie mit dem enzymatischen Punkt, der durch das Einsetzen des Fragments gebracht wurde, und überprüfen Sie die Fragmentgröße durch die Elektrophorese des Olipagesegels, um festzustellen, ob das Ziel-Fragment enthalten ist.

b. Auswahl der weißen Kolonie für den direkten PCR-Test

c. Verwenden Sie die Sequenzierung des T3-Starter-Subprimers oder des M13-Universal Sequencing-Protors, um festzustellen, ob ein Zielklon enthalten ist.

bei Wie berechnet man die Menge an PCR-Produkten, die in der Verbindungsreaktion benötigt werden?

Die Optimierung des Molenverhältnisses zwischen allgemeinen PCR-Produkten und Trägern auf 2:1 bis 10:1 (empfohlen 3:1) kann gute Ergebnisse erzielen, die folgende Formel verwenden können:

[Menge des eingesetzten Trägers (ng) × Insertionsfragmentgröße (kb) ÷ Trägergröße (kb)] × Molverhältnis des eingesetzten Fragments und des Trägers = Menge des eingesetzten Fragments (ng) Zum Beispiel: das molare Verhältnis des eingesetzten Fragments und der Trägerverbindung ist 3: 1, wenn der Träger 40ng in der Verbindungsreaktion hinzugefügt wird, ist die Insertionsfragmentgröße 1000bp, dann sollte die Menge des eingesetzten Fragments [40ng-Träger × 1kb-Insertionsfragment ÷ 2,928kb-Träger] × 3/1 = 40,1ng hinzugefügt werden.

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