Zero-Hintergrund-Flach-End-Schnellklon-Kit T4-Prinzip

Zero-Blunt Einfaches Schnellligationskit
pZERO-Blunt EinfachZero Hintergrund Flach End Schnellverbindung Kit
(ohne MCS)

Zero-Hintergrund-Flach-End-Schnellklon-Kit T4-Prinzip

Katalognummer: 42113

Zusammensetzung, Lagerung und Stabilität:

- Lagerung bei 20 ° C, die Wirkung der Verwendung innerhalb von 6 Monaten nicht beeinflussen.

Produktbeschreibung:

Zero-Hintergrund-Flat-End-Schnellverbindungskit ist ein ausgezeichnetes Zi-Kill-positiv selektiertes Klonsystem, das effektiv PCR-Produkte und alle DNA-Fragmente mit einem Flat-End klonen kann. Das Kit wirkt sowohl auf phosphorisierte als auch auf unphosphorisierte DNA-Fragmente. Über 90 % der positiven Rekombinationsklone werden in nur 5 Minuten durch die positive Selektion des Trägers und die Insertionssegmentverbindung erzielt. Das Flach-End-PCR-Produkt, das durch eine korrigierende Polymerase wie die Pfu-Polymerase verstärkt wird, kann direkt an den Klonträger angeschlossen werden. Verbindungsprodukte können häufig verwendete E. coli-Stämme direkt umwandeln.

Das Kit bietet einen neuartigen Zi-Kill-positiv selektierten Klon-Carrier pZERO-Blunt Simple. Der Träger enthält das tödliche zi-Kild-Gen, und wenn der Träger erfolgreich mit dem Fragment verbunden ist, kann das zi-Kild-Gen nicht richtig ausgedrückt werden, und Zellen, die ein recombinant enthalten, können normal wachsen; Wenn die Verknüpfung des Trägers mit dem Fragment nicht erfolgreich ist, wird das zi-Kild-Gen nach der Verknüpfung des Trägers korrekt ausgedrückt, und Zellen, die einen leeren Verknüpfungsträger enthalten, können nicht überleben, d.h. "Null Null" Hintergrund. Diese positive Screenstrategie erfordert kein Blau-Weiß-Screening und beschleunigt den Klonscreenprozess erheblich.

pZERO-Blunt Simple eliminiert polyklonale Enzym-Schnitte in der Nähe der Insertionsstelle und erfordert die Importierung geeigneter Enzym-Schnitte auf PCR-Amplifikationsprimern. Wenn Sie zu diesem Zeitpunkt die DNA-Enzyme-Schnittstelle verwenden, die von PCR-Amplifikationsprimern importiert wurde, wird die Enzyme-Schnittreaktion nicht von Restriktionsenzymen an anderen polyklonalen Enzyme-Schnittstellen auf dem T-Träger beeinflusst, was die Enzyme-Schnitteffizienz erheblich verbessern und die Subklonerfolgsrate erhöhen kann.

Betriebsschritte:

1. Vorbereitung der Verbindungsreaktion：

Das Flach-End-PCR-Produkt oder das Flach-End-Fragment nach dem enzymatischen Schnitt kann durch die Elektrophorese des Ionasegels zurückgewonnen werden (mit Langwellen-UV-Schnittkleber oder sichtbarem Lichtdurchlässigem Schnittkleber, um eine DNA-Schädigung zu vermeiden, die zu Verbindungsausfällen führt). Das Morphverhältnis zum Träger ist 3:1. Die von uns hergestellten Schnellreinigungsrecycling-Kits für DNA-Produkte können DNA-Fragmente über 70 bps gut recyceln.

2. Schnelle Verbindungsreaktion:

1) In einem Standard von 10ml Verbinden Sie das Reaktionssystem, fügen Sie 1mL 40, <NUM>#1 von pnull-stumpf einfachem Chml PCR-Produkt (unter normalen Bedingungen ist es nicht notwendig, das PCR-Produkt genau zu quantifizieren, das molare Verhältnis des allgemeinen PCR-Produkts zu dem Träger auf 1: 1 bis 10: 1 optimiert wird, um gute Ergebnisse zu erzielen, empfohlen 3: 1, siehe Anhang), 5ml 2´Quick Ligation Buffer und 0,9ml T4 DNA Ligase, der Rest mit Sterilisierungswasser ergänzt.

Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden System:

In der Regel wird die T4 DNA Ligase hinzugefügt.

2) Verbinden Sie bei 22 ° C für 5-10 Minuten (in der Regel kann in einem PCR-Instrument durchgeführt werden).

In der Regel wird eine 22 ° C-Verbindung für 5-10 Minuten empfohlen, > 3 kb lange Segment-Verbindung kann auf 30 Minuten verlängert werden. Es wird nicht empfohlen, mehr als 30 Minuten zu verbringen, um die Anzahl der Konverter zu reduzieren.

3) Auf Eis abkühlen und dann umwandeln oder bei -20 ° C lagern.

3. Umwandlung:

1) 100ml Gefühl Zustand Zellen, auf Eis gelegt, Wan vollständig aufgefroren, um die Zellen gleichmäßig suspendieren mehrere Male leicht schütteln.

2) Beitritt 4-5ml Verbindungsflüssigkeit (maximal vollständig hinzugefügt, sofern das Verbindungsflüssigkeitsvolumen nicht 1/10 des empfindlichen Zellvolumens übersteigt) und vorsichtig vermischt. 30 Minuten auf Eis lassen.

3) 42 ° C Wasserbad heiß für 90 Sekunden. 2-3 Minuten auf Eis lassen.

4) Plus 500mLB oder SOC-Medium (ohne Antibiotika), Oszillationskultur bei 37 ° C bei 150 rpm für 60 Minuten.

5) wird 200ml Bakterien beschichtet in Ampicillin su(100mg/ml auf der Tablette.

Die Dosierung der beschichteten Bakterien wird entsprechend der Effizienz der Verbindung und der Empfindlichkeit der empfindlichen Zellen angepasst, wenn die erwartete Klonierung weniger ist, kann ein Teil der Kulturflüssigkeit nach Zentrifugierung (4.000 Umdrehungen pro Minute, 2 Minuten) abgezogen werden, die ausreichende Menge an Mediumsuspension der Bakterien nach der Entnahme der gesamten oder in angemessener Menge in einer Platte beschichtet werden (die restlichen beschichteten Bakterien können bei 4 Grad aufbewahrt werden, am 2. Tag, wenn die Anzahl der konvertierten Kolonien gering ist, können die restlichen Bakterien auf eine neue Platte beschichtet werden).

6) Die Tablette wird 1 Stunde bei 37 ° C nach vorne gelegt, um zu viel Flüssigkeit aufzunehmen, und die Umkehrkultur wird über Nacht durchgeführt.

4. Filtern:

5. Regelmäßige Prüfung: 1-5 ml LB (mit einer endgültigen Konzentration von 100) der erhaltenen Kolonieneimpfungmg / ml Ampicillin su) Medium, 37 ℃ Schüttelbett Oszillationskultur über Nacht, nach der Erhaltung der Spezies Extraktion der Plasmide, Anwendung von PCR oder Enzym-Cutting-Methode zur Identifizierung der richtigen Einfügung der Fragmente.

6. Schnelle Detektion: Kolonien für den direkten PCR-Test ausgewählt (siehe Molecular Cloning Version 3 oder die Anleitung zu unserem CV05-Universal T-Carrier Colony PCR Identification Kit).

7. Sequenzierungsidentifikation: Verwenden Sie die Sequenzierung des mit dem Kit gelieferten Vorgangs oder des T7-Starter-Sub-Vorgangs, um festzustellen, ob ein Zielklon enthalten ist.

Dieses Kit kommt mit Sequenzierungs-Primären (auch für die Identifizierung von PCR-Primären in Kolonien):

Anhang:

bei Wie berechnet man die Menge an PCR-Produkten, die in der Verbindungsreaktion benötigt werden?

Die Optimierung des Molenverhältnisses zwischen allgemeinen PCR-Produkten und Trägern auf 1:1 bis 10:1 (empfohlen 3:1) kann gute Ergebnisse erzielen, die folgende Formel verwenden können:

[Menge des eingesetzten Trägers (ng) × Insertionsfragmentgröße (kb) ÷ Trägergröße (kb)] × Molverhältnis des eingesetzten Fragments und des Trägers = Menge des eingesetzten Fragments (ng) Zum Beispiel: das molare Verhältnis des eingesetzten Fragments und der Trägerverbindung ist 3: 1, wenn der Träger 40ng in der Verbindungsreaktion hinzugefügt wird, ist die Insertionsfragmentgröße 500bp, dann sollte die Menge des eingesetzten Fragments [40ng-Träger x 0,5kb-Insertionsfragment ÷ 2,974kb-Träger] × 3/1 = 20,2ng hinzugefügt werden.

Zero-Hintergrund-Flach-End-Schnellklon-Kit T4-Prinzip