pBLUE -T-Trägerklonkit T4-Prinzipien-Träger und andere

pBLUE-T Trägerklonkit

pBLUE -T-Trägerklonkit T4-Prinzipien-Träger und andere

Katalognummer: 42014

Zusammensetzung, Lagerung und Stabilität:

- Lagerung bei 20 ° C, die Wirkung der Verwendung innerhalb von 6 Monaten nicht beeinflussen.

Produktbeschreibung:

Viele hohe Temperatur-DNA-Polymerasen, wie Taq-DNA-Polymerase, Tth-DNA-Polymerase und andere, vergrößern die PCR-Produkte in 3'-An den Enden ist eine hervorragende Basis A vorhanden, so dass das PCR-Produkt mit 3 'verwendet werden kann.-Ein Träger mit einer ausgeprägten Basis T nach dem Ende kann bequem geklont werden. Der pBLUE-T-Träger stammt aus dem pBlueScript II SK(+) Plasmid und wird an der EcoRI-Enzym-Schnittstelle mit einer entsprechenden Sequenz hinzugefügt, die direkt nach dem XCM I-Enzym-Schnitt an seinem 3'-Ende ungepaarte T-Basen erzeugt, was eine höhere Rekombinationseffizienz bietet. Zwei ECOR I-Stellen, die speziell für die beiden Enden der pBLUE-T-Trägereinserstellungsstelle ausgelegt sind, ermöglichen die Erkennung der Einsetzfragmente mit einer kostengünstigen und effizienten ECOR I-Monolyse; Gleichzeitig enthält der pBLUE-T-Träger keine NdeI- oder NcoI-restriktiven Enzym-Sites und kann bequem verwendet werden, um Gene zu klonen, die die oben genannten Enzym-Sites enthalten. Darüber hinaus verfügen unsere Trägerverbindungssysteme über geringen Hintergrund (weniger als 10% der blauen Flecken), eine hohe Rekonstruktionsrate (über 90% der weißen Flecken haben Einsetzsegmente) und eine schnelle Verbindung. Die technischen Daten zu den pBLUE-T-Trägern sind am Ende dieser Beschreibung aufgeführt, deren vollständige Sequenz auf die pBlueScript II SK(+)-Sequenz verweisen kann, allerdings ist die Sequenz der Polyklonase-Sites etwas anders.

Die Sequenzierung kann mit T3-, T7- und M13-Universal-Sequenzierungsinitiatoren erfolgen (siehe nachfolgende Abbildung)

Betriebsschritte:

1. Vorbereitung der Verbindungsreaktion:

Ob ein PCR-Produkt gereinigt werden soll, hängt von der Qualität des amplifizierten Produkts ab. Wenn das PCR-Produkt sehr sauber ist, kann eine direkte Verbindungsreaktion ohne Reinigung durchgeführt werden. Doch wenn es sich um ein Plasmid-Vorlage PCR-Produkt handelt, muss es gereinigt werden, und das Vorlage Plasmid kann auch weiße Flecken bilden. PCRDas Produkt kann durch die Elektrophorese des Gels von Againe isoliert werden. Das Unternehmen produziert DNA-Produkte schnell reinigen Recycling-Kit für 7DNA-Fragmente über 0 bp können gut recycelt werden.

Taq, Tth, AmpliTaq und KlenTaq DNA-Polymerase-amplifizierte PCR-Produkte, die alle mit einem hervorragenden 3’ Ende versehen sind-A。 Besitzen3’-Das PCR-Produkt am A-End kann direkt mit dem pBLUE-T-Träger geklont werden. Haben Sie 3'®Das PCR-Produkt, das durch die DNA-Polymerase (Hypophylase) mit 5' Extrocase-Aktivität verstärkt wird, ist flach-endend. Um dieses flach-endende PCR-Produkt zu klonen, sollte zuerst 3' durchgeführt werden.-Arbeit mit A.

2. Regelmäßige Verbindungsreaktionen:

1) In einem Standard von 10ml Verbinden Sie das Reaktionssystem, fügen Sie 1ml30% von pblue-tFahrzeuge, Xml PCRProdukt (unter normalen Bedingungen nicht notwendig)PCRPräzise Quantifizierung des Produkts, das allgemeine PCR-Produkt und das Molenverhältnis des Trägers auf 2: 1 bis 10: 1 optimiert werden, können gute Ergebnisse erzielt werden, empfohlen 3: 1),1ml 10´Ligation Pufferund 0,5-1ml(T4-DNA mit 2,5-5 Weiss-EinheitenLigase， Der Rest wird mit Wasser ergänzt. Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden System:

In der Regel wird die T4 DNA Ligase hinzugefügt.

2) 16 ° C Verbindung über Nacht (in der Regel kann in einem PCR-Instrument abgeschlossen werden).

Normalerweise wird eine Übernachtungsverbindung bei 16 ° C empfohlen (10mlSystemstandardverbindungsenzym 2,5Weiss EinheitenSie können den größten Umwandler erhalten. Allerdings kann das System mit dem PEG Enhancer die Verbindungseffizienz mehrmals verbessern.，Bei hohen Verbindungsenzymen (10mlSystemempfohlene Verbindungsenzymmenge 5Weiss Einheiten16 ° C Verbindungen für 30 Minuten können die Anforderungen der allgemeinen Studie erfüllen.

3)Auf Eis abkühlen und dann umwandeln oder bei -20 ° C lagern.

3. Schnelle Verbindungsreaktion:

1) Die Reaktion erfolgt nach dem folgenden System:

In der Regel wird die T4 DNA Ligase hinzugefügt.

2) 22 ° C Verbindung für 5-10 Minuten (in der Regel kann in einem PCR-Instrument durchgeführt werden).

2 ´Der Quick Ligation Buffer enthält bereits alle optimierten Schnellverbindungsbestandteile und empfiehlt eine Verbindung bei 22 ° C für 10 Minuten.（10mlSystemverbindungsenzym 5Weiss EinheitenLange Abschnittverbindungen können bis zu 30 Minuten verlängert werden) können in der Regel zufriedenstellende Ergebnisse erzielen. Darüber hinaus kann das System auch 30 Minuten bei 16 ° C angeschlossen werden (10mlSystemverbindungsenzym 5Weiss-Einheiten) erfüllen die Anforderungen der allgemeinen Forschung.

3)Auf Eis abkühlen und dann umwandeln oder bei -20 ° C lagern.

4. Umwandlung:

bei50-100ml Gefühl Zustand Zellen, auf Eis gelegt, Wan vollständig aufgefroren, um die Zellen gleichmäßig suspendieren mehrere Male leicht schütteln.

beiBeitritt 4-5mlVerbindungsflüssigkeit (maximal vollständig hinzugefügt, sofern das Volumen nicht mehr als 1/10 des Volumens der empfindlichen Zellen ist) leicht vermischen. Auf Eis platziert30 Minuten. 42 ° Wasserbad heiß 90Sekunden. Auf dem Eis 2~ 3 Minuten.

beiPlus 500mLB- oder SOC-Medium (ohne Antibiotika), 37°C, 150 rpmOszillationskultur für 60 Minuten.

beiwird 200mlBakterien beschichtet im Voraus 16ml 50mg/ml IPTGund 40ml 20 mg/ml auf X-gal beschichteten Tabletten.

Die Dosierung der beschichteten Bakterien wird entsprechend der Effizienz der Verbindung und der Empfindlichkeit der empfindlichen Zellen angepasst, wenn die erwartete Klonierung weniger ist, kann ein Teil der Kulturflüssigkeit nach Zentrifugierung (4.000 Umdrehungen pro Minute, 2 Minuten) abgezogen werden, die ausreichende Menge an Mediumsuspension der Bakterien nach der Entnahme der gesamten oder in angemessener Menge in einer Platte beschichtet werden (die restlichen beschichteten Bakterien können bei 4 Grad aufbewahrt werden, am 2. Tag, wenn die Anzahl der konvertierten Kolonien gering ist, können die restlichen Bakterien auf eine neue Platte beschichtet werden).

beiDie Tablette wird 1 Stunde bei 37 ° C nach vorne gelegt, um zu viel Flüssigkeit aufzunehmen, und die Umkehrkultur wird über Nacht durchgeführt.
5 Filtern:

1). Blau-Weiß-Filter des Konverters:

Wenn exotische DNA-Fragmente in pBLUE-T eingesetzt werdenDurch ausländische QuellenDie Präsenz einer Nukleinsäuresequenz in der DNA verändert die Codierung des LacZ-Gens und beeinflusst damit seine Produkte.b-Halbalaktosidasea-Die Aktivität des Fragments und somit der rekombinierte Klon ist auf der X-gal/IPTG-Platte weiß, anstatt der rekombinierte Klon blau dargestellt. Manchmal.Ein Abschnitt einfügen hat keine AuswirkungenDas lacZ-Gen liest den Code-Feld oder fügt die Fragmente zu klein ein, in diesem Fall zeigt die Kolonie (rekombinierte Klone) hellblau oder zeigt hellblaue Flecken im Zentrum der Kolonie mit äußeren Kreisen weiß (Fischauge blaue Flecken). Wählen Sie eine weiße oder hellblaue Kolonie aus, die auf IPTG/X-gal-Tabletten wächst, wählen Sie mit Zahnstiften ein flüssiges Medium aus, das Ampicillin su enthält, und kultivieren Sie es über Nacht bei 37 ° C.
2). Identifizierung des Konverters:

a.Extrahieren Sie das Plasmid mit den Bakterien der oben kultivierten weißen Kolonie, schneiden Sie es mit ECOR I Monoenzym oder mit einem anderen geeigneten Enzym und überprüfen Sie die Fragmentgrösse durch die Elektrophorese mit Gel-Epsilose, um festzustellen, ob die Zielfragmente enthalten sind.

b.Auswahl der weißen Kolonien für den direkten PCR-Test (siehe Molecular Cloning Version 3 oder konsultieren Sie uns)

c. Die Sequenzierung von T3- und T7-Initiator-Subprimern oder anderen geeigneten Primären zur Bestimmung des Zielklons.

Wie berechnet man die Menge an PCR-Produkten, die in der Verbindungsreaktion benötigt werden?

Die Optimierung des Molenverhältnisses zwischen allgemeinen PCR-Produkten und Trägern auf 2:1 bis 10:1 (empfohlen 3:1) kann gute Ergebnisse erzielen, die folgende Formel verwenden können:

[Menge des eingesetzten Trägers (ng) × Insertionsfragmentgröße (kb) ÷ Trägergröße (kb)] × Molverhältnis des eingesetzten Fragments und des Trägers = Menge des eingesetzten Fragments (ng) Zum Beispiel: das molare Verhältnis des eingesetzten Fragments und der Trägerverbindung ist 3: 1, wenn der Träger 40ng in der Verbindungsreaktion hinzugefügt wird, ist die Insertionsfragmentgröße 1000bp, dann sollte die Menge des eingesetzten Fragments [40ng-Träger × 1kb-Insertionsfragment ÷ 2,984kb-Träger] × 3/1 = 40,2ng hinzugefügt werden.

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