Organoide Kulturkits (Leberkrebs, Darmkrebs, Nierenkrebs)

Gebrauchsanweisung

1. Original
(1) Das entnommene Gewebe muss in einer vorgekühlten (2-8 ° C) Probenflasche mit Gewebekonservationsflüssigkeit E platziert werden und schnell in ein sauberes Labor zur Gewebebehandlung und Zellseparation transportiert werden, fotografiert und Informationen registriert werden.
(2) Bereiten Sie mehrere Petrischalen vor und fügen Sie den 4 ° C vorgekühlten ursprünglichen Kulturpuffer B zur Reserve hinzu.
(3) Probenahme Flasche desinfizieren, das Gewebe in eine Petrischale legen, dreimal mit dem ursprünglichen Kulturpuffer B reinigen, mit dem Augen Jian oder Chirurgie dao schneiden Gewebe Jian in ein Volumen von etwa 1-3mm3Organisationsblock.
(4) Gewebe mit menschlichem Brustkrebs Primärgewebe Verdauung ye C Verdauung, 37 ° C Schockverdauung 10-20min, (Beobachten Sie die Verdauung jederzeit während der Verdauung).
(5) Nehmen Sie eine kleine Menge an Flüssigkeit unter dem Mikroskop beobachtet, nachdem mehr einzelne Zellen oder Zellkluster unter 70um beobachtet wurden, fügen Sie dreimal das Volumen der primären Kulturpuffer B zur Beendigung der Verdauung hinzu.
(6) Filtern Sie mit einem Sieb mit einem Durchmesser von 100um, sammeln Sie das Filter und entfernen Sie es nach 5 Minuten nach 300 g angereicherter Zentrifuge und fügen Sie den ursprünglichen Kulturpuffer B hinzu, um die Zentrifuge neu zu suspendieren.
(7) Matrix-Kleber Berechnung: Beobachten Sie das gesammelte Gewebevolumen nach Schritt 6 und fügen Sie das 25-fache Gewebevolumen des Matrix-Klebers hinzu (abs9495(Wiederholung der Platte.
(8) 24-Loch-Zellkulturplatte zum Beispiel, je Loch-Klebstoff 25ul Gewebe-Matrix-Klebstoff-Mischung für die Platte (Betrieb bei 4 ° C).
(9) Legen Sie die verkleidete Platte in eine 37 ° C-Kultivkammer für 10-15 Minuten zu kleben und fügen Sie menschliches Brustkrebsorganenmedium A (Wiederherstellung von Raumtemperatur) zur Kultivierung hinzu.
2. Organoide Übertragungskultur
(1) Pipette Pistole Absaugen des Mediums, fügen Sie 1-2ml 4 ° C Organübertragung Kulturpuffer G 2 min pro Loch.
(2) Pipette Pistole sanft blasen Sie die Substrate Kleber, sammeln Sie in 15 ml Zentrifugerrohr, 4 ° C 10 min stehen. (Alle 6-8 Löcher in einer Gruppe)
(3) a: Wenn die Anzahl der Organoiden nicht ausreichend ist oder das Volumen kleiner ist: Zentrifugieren Sie 5 min, um die Oberklärung zu entfernen, fügen Sie eine angemessene Menge an Organoiden-Transformationskulturpuffer G hinzu, um sie in ein 1,5 ml-Zentrifugerrohr zu suspendieren, 300 g Zentrifugieren Sie 5 min, um die Flüssigkeit zu entfernen, um Schritt 4 zu führen.
b: Wenn die Anzahl der Organoiden größer ist oder das Volumen größer ist: Zentrifugieren Sie 5min, um die Oberfläche zu entfernen, fügen Sie die angemessene Menge an Organoiden zur Verdauung D zu verdauen 2-3min, fügen Sie den Organoiden zur Verdauung G hinzu, um die Verdauung zu beenden, Zentrifugieren Sie 5min, um die Mischung zu entfernen, fügen Sie die angemessene Menge an Organoiden zur Verdauung G hinzu, um den Organoiden zur Verdauung G in ein 1,5 ml-Zentrifugeröhrchen zu suspendieren, 300 g Zentrifugieren Sie 5min, um die Flüssigkeit zu entfern
(4) Nach der organoiden Sammlung, fügen Sie die Matrix-Kleber resuspendiert, je Loch 25ul Matrix-Kleber in 24-Loch-Zellkulturplatte gelegt, in 10-15min in der Kultivbox 500ul menschlichen Brustkrebs-Organmedium A hinzufügen.
3. Einfrieren der Organe
(1) Pipette Pistole Absaugen des Mediums, fügen Sie 1-2ml 4 ° C Organübertragung Kulturpuffer G 2 min pro Loch.
(2) Pipette Pistole sanft blasen Sie die Substrate Kleber, sammeln Sie in 15 ml Zentrifugerrohr, 4 ° C 10 min stehen. (Alle 6-8 Löcher in einer Gruppe)
(3) Zentrifugieren 5min entfernen, fügen Sie eine angemessene Menge an organoiden Transformation-Kulturpuffer G wieder suspendieren, 300 g Zentrifugieren 5min entfernen Flüssigkeit.
(4) Fügen Sie eine angemessene Menge an Organoid-Gefrierflüssigkeit F hinzu und blasen Sie sanft die Wiedersuspension mit einer 24-Loch-Zellkulturplatte zum Beispiel: Gefrieren Sie 1 Röhrchen mit einer Dichte von 2 Löchern und einem Volumen von 1,4 ml pro Röhrchen.
(5) Kennzeichnungsinformationen, nach der Abkühlung des Verfahrens, in flüssigen Stickstoff zu bewegen, um langfristig zu erhalten.
4. Organische Wiederherstellung
(1) Nehmen Sie 10 ml Organübertragung Kulturpuffer G in 15 ml Zentrifugerrohr.
(2) Entfernen Sie die gefrorenen organoiden Zellen aus dem flüssigen Stickstoff-Tank und schmelzen sie schnell in einem 37 ° C Wasserbad.
(3) während des Wasserbadschmelzprozesses muss das Gefrierrohr sanft geschüttelt werden, um sicherzustellen, dass die Gefrierflüssigkeit innerhalb von 1-2 Minuten aufschmilzt.
(4) Die gelösten organoiden Zellen schnell in eine 15ml-Zentrifugeröhre übertragen, 6-8 Mal sanft mit einer Pipette blasen, 300g 5 min zentrifugieren und dann die Oberflüssigkeit entfernen und die organoiden Fällungen sammeln. Fügen Sie eine angemessene Menge an Organoid Transplantation Kulturpuffer G resuspendiert in 1,5 ml Zentrifugerrohr 300 g Zentrifuge für 5 min.
(5) Matrix-Klebstoff resuspendiert, je Loch 25ul Matrix-Klebstoff in 24-Loch-Zellkulturplatte gelegt, 10-15min in der Kultivkammer gelegt, 500ul menschliches Brustkrebs-Organmedium A hinzugefügt.