Das One Step Seamless Cloning Kit

Ein Schritt nahtloses Klonen Kit (Einzelteil)

Das One Step Seamless Cloning Kit

Katalognummer:42111

Verpackungsmenge:

Produktlagerung:-20°C Aufbewahrung, um wiederholtes Einfrieren zu vermeiden

Produktbeschreibung:Ein-Schritt-Methode nahtloses Klonen Kit ist nicht abhängig von T4-Konektase, nicht durch die enzymatische Schnittstelle des Trägers und Zielsegments eingeschränkt, sondern direkt mit überlappenden Fragment-Rekombination-Methode, mit speziellen Enzym-Kombinationen können die beliebige Methode linearisiert Träger und PCR-Fragmente mit ihren beiden Enden mit 16-25bp-Überlappungsbereich gerichtete Rekombination verbunden werden, kann ein effektives gerichtetes nahtloses Klonen von A-End- oder Flach-End-PCR-Produktfragmenten zu beliebigen Stellen des Trägers innerhalb von 30 Minuten erreicht werden.

Eigenschaften:

1. Ein 50bp-15kb PCR-Amplified-Fragment (Layer/A-End) Klon kann in 30 Minuten an beliebigen Stellen eines beliebigen Trägers eingefügt werden.

2. Die Klonierung kann an jedem beliebigen Ort ohne Einschränkung der Verfügbarkeit des Trägers und der Einsetzungs-Fragment-Enzym-Schnittstelle und des Endes / des klebrigen Endes erfolgen.

3. Ein nahtloser Klon führt keine unerwünschten Basensequenzen durch den Einsatzpunkt.

4. Nicht abhängig von Konektase und Phosphatase, effizient, genau, kann die Klonpositive Rate bis zu 95% erreichen.

Ein Schritt nahtlose Klonen Kit Prinzip Schema:

Vorbereitung der Linearisierung von Trägern und Einfügung von DNA-Fragmenten:

AVorbereitung linearer Träger

(1). Quelle des Enzymschneidens: Der vom Enzymschneiden gewonnene lineare Träger, flaches Ende oder Klebstoff, Mono- oder Dual-Enzymschneiden, kann nach dem Enzymschneiden zurückgewonnen werden.

Hinweis: Es gibt keine Doppelketten-DNA-Konnektase in einem Schritt nahtlose Klonen Reaktionssystem und keine Träger-Selbstverbindung-Reaktion auftreten. Deshalb sind auch lineare Träger, die monoenzymatisch hergestellt werden, keine endgültige Dephosphorsäurebehandlung erforderlich. Die falsch positiven Klone (ohne Insertionsfragmente), die nach der Transformation des Rekombinationsprodukts auftreten, entstehen durch die enzymatische Transformation eines vollständig nicht linearen Ringträgers. Wir empfehlen, dass die enzymatische Rückgewinnung dieses Anteils an nicht linearen Trägern auf ein niedriges Zui reduzieren kann.

(2). Reverse PCR-Quelle: Es wird empfohlen, eine hochfidelitäre DNA-Polymerase vorzubereiten, wenn die Amplifikationsstreifen allein durch die Reinigung von PCR-Produkten (Artikelnummer DC012-50) oder andernfalls durch Klebstoff-Recycling (Artikelnummer DC011-50) erhalten werden können.

Hinweis: Umkehrte PCR-Plasmid-Schablonen sind auch nicht-lineare Träger und können auch zu falsch positiven Klonen (ohne Insertionsfragmente) führen, so dass die Verdauung der Plasmid-Schablonen mit Dpn I-Endocytease vor der Reinigung der linearen Träger der PCR-Quelle (PCR-Produkt) den Hintergrund verringern und die positive Rate erhöhen kann. Aber im Allgemeinen ist die Rekuperation von Klebstoff ausreichend, um den Anteil dieser nicht-linearen Träger auf zui niedrig zu reduzieren, daher empfehlen wir auch die Rekuperation von Klebstoff für lineare Träger der umgekehrten PCR-Quelle.

BVorbereitung der Einführung von DNA-Fragmenten

(1). Das allgemeine Prinzip für das Design eines nahtlosen Klonbeträgers in einem Schritt ist: Durch die Einführung einer homogenen Sequenz am Ende des linearen Klonbeträgers am Ende des Protors 5 ′, werden die am Ende des Produkts 5 ′ und 3 ′ mit einer vollständig konsistenten Sequenz von Wan (16 bp bis 20 bp) versehen, die den beiden Enden des linearen Klonbeträgers entspricht.

(2). Insertion-Fragment-Prototype-Design: Ein Klon-Prototype umfasst die Insertion von Fragment-spezifischen Prototype-Sequenzen und Überlappungssequenzen.

Klonen von positiven Vorläufern (5’-3’): Sequenz von überlappenden Bereichen mit linearen Trägern in Richtung 16-25 nt (ab 3’-Ende) + Sequenz von spezifischen Vorläufern in Richtung Fragmente (18-25 nt)

Umkehrtes Klonen (5’-3’): Umkehrtes 16-25 nt-Überlappungsbereich des linearen Trägers (ab 3’-Ende) + Umkehrtes Spezifisches Einfügen (18-25 nt)

Hinweis: Die Basenzahl der überlappenden Zonen muss mindestens 16 bp sein und die Tm-Werte zwischen mehreren überlappenden Zonen müssen gleichbleiben und DieDie Die Die Die Tm-Werte müssen gleichbleiben und bei DieDie Die Die Die Die Die Überlappungsbereiche müssen gleichbleiben und HinHinweis: 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C), sonst können die Basenz

Entsprechend der Struktur des linearen Trägerensendes (5 ′ hervorragend, 3 ′ hervorragend, flaches Ende) unterteilt sich das Einführungsdesign auch in 3 Fälle, wie folgt:

Die beiden Enden des linearen Trägers unterscheiden sich aufgrund der linearen Methode (z. B. Monoenzym-Schnitt, Bienzym-Schnitt, Reverse PCR), kann eine beliebige Kombination von zwei oder zwei der oben genannten drei Endstrukturen sein, das Prinzip des Einsetzens eines segmentspezifischen Primierdesigns folgt dem Prinzip des allgemeinen Primierdesigns.

Bei der Berechnung der Vergrößerungsprozidentkühlungstemperatur ist es einfach, den Tm-Wert der genspezifischen Vergrößerungssequenz zu berechnen, und die homogene Sequenz am Ende des Trägers sollte nicht an der Berechnung beteiligt sein.

(3). Auswahl des Enzyms: Es wird empfohlen, eine hochfidelitäre DNA-Polymerase oder eine PCR-Mix (Artikelnummer: P517-05 oder P814-05) zu verwenden.

(4). Reaktionsbedingungen: In der Regel können die spezifischen Polymerase-Anweisungen entsprechend durchgeführt werden.

(5). Reinigung des Einsetzsegments

l Optional: Wenn das Fragment aus einer Plasmid-Schablone stammt und das Plasmid die gleiche Widerstandsfähigkeit wie der Rekombinationsträger hat, verdauen Sie die Plasmid-Schablone vor der Reinigung mit Dpn I-Enzym, um den Hintergrund zu verringern und die Positivitätsrate zu erhöhen.

l Wenn das Fragment einzeln ist, wird empfohlen, das Fragment mit einem PCR-Produkt-Reinigungskit (Artikelnummer DC012-100) zu reinigen.

l Bei nicht spezifischer Verstärkung wird empfohlen, die Fragmente mit einem Klebstoff-Recyclingkit (Artikelnummer DC011-100) zu recyceln.

l Mit dieser Methode zu klonen, wird der Enzym-Schnittpunkt des Trägers zur Linearisierung beim Spleizen fehlen, wenn es strenge Anforderungen an den Enzym-Schnittpunkt gibt, wird empfohlen, die Auswahl des Enzym-Schnittpunkts zu beachten, wenn nötig, kann inÜberlappende Regionensequenzen von positiven Reverse-Klonen-Primären und spezifische GensequenzenErhöhen Sie die fehlenden Basen, um die ursprünglichen enzymatischen Schnittstellen wiederherzustellen (siehe nachfolgende Beispiele).

l Wenn das rekombinierte Plasmid für die Proteinexpression verwendet wird, beachten Sie bei der Gestaltung des Primärs, dass die für die Proteinexpression und Reinigung erforderlichen Sequenzen (z. B. Starter, RBS-Sequenz, Start-Codon, End-Codon, Protein-Label usw.) nicht zerstört werden.

Beispiel für das Design eines positiven Vorläufers (EcoR I Enzym-Schnitt):

Wie oben dargestellt, wird der Träger durch das Ecor I-Enzym geschnitten und bildet ein 5' ausgeprägtes Ende:

Gemäß dem obigen Konstruktionsprinzip können die Berechnungen vom 3'-Ende beginnen und die Rückrechnung von 16bp-25bp (in diesem Beispiel wird die gleiche Sequenz mit 20 bp-Enden überlappt) vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass der Tm-Wert des überlappenden Bereiches konsistent bleibt und bei 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C).

Die Vorrichtung ist wie folgt: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNN 3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung des oben genannten Protor-Designs verschwindet der EcoR I-Enzym-Schnittpunkt (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn ein EcoR I-Enzym-Schnitt beibehalten werden muss, muss die fehlende EcoR I-Identifikations-Sitzsequenz aattc zwischen der 20 bp-Überlappungssequenz am Ende des Trägers und der Zielsegment-spezifischen Primiersequenz ergänzt werden, und der EcoR I-Enzym-Schnitt bleibt nach Abschluss der Klonverbindung vorhanden (Retention-Enzym-Schnitt).

Genau wie folgt: 5'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Ausführungsbeispiel des Reverse-Initiator-Designs (Hind III-Enzym-Schnitt):

Wie oben dargestellt, wird der Träger durch das Hind III-Enzym geschnitten und bildet ein 5' ausgeprägtes Ende:

Gemäß dem obigen Konstruktionsprinzip können die Berechnungen vom 3'-Ende beginnen und die Rückrechnung von 16bp-25bp (in diesem Beispiel wird die gleiche Sequenz mit 20 bp-Enden überlappt) vor der Zielsegmentspezifischen Primierfolge hinzugefügt werden. Stellen Sie sicher, dass der Tm-Wert des überlappenden Bereiches konsistent bleibt und bei 60 °C (AT-Paar = 2 °C und GC-Paar = 4 °C).

Die Umkehrlösung ist wie folgt: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNN 3'

Hinweis: Nach Abschluss der Klonverbindung des oben genannten Protor-Designs verschwindet der Hind III-Schnittpunkt (der Enzym-Schnittpunkt bleibt nicht erhalten).

Wenn ein Hind-III-Enzym-Schnitt beibehalten werden muss, muss die fehlende Hind-III-Identifikations-Sitzsequenz agctt zwischen der 20 bp-Überlappungssequenz am Carrier-Ende und der Zielsegment-spezifischen Primiersequenz ergänzt werden, wobei der Hind-III-Enzym-Schnitt noch vorhanden ist (Retention-Enzym-Schnitt).

Genau wie folgt: 5'CTGCCATCGGATCGTTCGCAAgctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Schritte zur nahtlosen Klonreaktion:

Hinweis: 2 × OneStep Cloning Mix enthält den Verbindungsverstärker PEG ist sehr klebrig, klebriger, wenn es aus dem Kühlschrank bei niedrigen Temperaturen herausgenommen wird, kann in der Hand für ein paar Minuten gefroren werden, um die Temperatur zu erhöhen, um die Viskosität zu verringern (ohne Auswirkungen auf die Qualität), leicht gemischt und sofort zentrifugiert, um den Rohrboden zu sammeln.

1. Einrichten des Reaktionssystems gemäß der folgenden Tabelle (Herstellung bei Raumtemperatur mit PCR-Röhren möglich)

* Der Träger wird in der Regel mit 20-50 ng eingesetzt, und das Moleverhältnis zwischen dem eingesetzten Segment und dem Träger liegt am besten zwischen 2: 1 und 3: 1; Wenn das eingesetzte Segment kleiner als 200 bps ist, wird das Morbelverhältnis des eingesetzten Segments zu dem Träger mit 5: 1 verwendet.

2. Leicht mischen, auf 50°C-Reaktion für 15 Minuten (kann auf einem PCR-Instrument durchgeführt werden), nach Beendigung der Reaktion wird die PCR direkt auf Eis umgewandelt oder auf -20 gespeichert°C. Kürzere Fragmente wie 100bp-1kb benötigen nur 15 Minuten, um genügend Konverter zu erhalten, während die Verbindung zu längeren Fragmenten die Reaktionszeit auf 60 Minuten verlängern kann.

3. Nehmen Sie 5 µl des Reaktionsprodukts und verwandeln Sie es gemäß der Anleitung für die Sensorzellen (wenn es weniger Transformatoren gibt, können alle Produkte verwandelt und alle Transformatoren beschichtet werden).

Identifizierung eines positiven Klons:

Je nach Umstand kann eine Koloniale PCR-Identifizierung ausgewählt werden, um Plasmide (Artikelnummer 31013-100) für eine restriktive Intracetase-Identifizierung oder Sequenzierung zu extrahieren.

Das One Step Seamless Cloning Kit